1、1菊花花瓣的组织培养+生命科学与化学学院生物技术试验班20080403801005 壳壳来了指导老师: 2010 年 9 月 13 日至 11 月 19 日2目 录摘要 4关键词 4前言 41 实验材料 51.1 实验材料. 52 菊花外植体的制备 52.1 药品. 52.2 物品器材. 62.3 方法. 72.3.1 MS 培养基的配制 72.3.2 灭菌. 72.3.3 加激素和外植体的消毒. 72.3.4 菊花花瓣接种. 72.3.5 培养. 72.4 后续 73.菊花的分化培养. 73.1 试剂 83.2 灭菌的物品 83.3 方法 83.3.1 MS 培养基的配制 833.3.2 加
2、激素和分化. 83.3.3 培养. 83.4 后续 84.菊花的生根培养. 84.1 试剂 84.2 灭菌物品 84.3 方法 84.3.1 MS 培养基的配制 84.3.2 加激素和分化. 84.3.3 培养. 84.4 后续 85 结果与讨论. 86 实验建议. 11主要参考文献 124摘要: 述菊花花瓣组织培养的备件、生长与分化情况及意义。关键词: 无菌操作、菊花、花瓣、组织培养。前言： 植物组织培养（tissue culture）是二十世纪初兴起的一项高新生物技术，至今已经有一百多年的历史，如今已成为了生物领域里面十分活跃的技术。植物组织培养开始走上工厂化和商业化始于 20 世纪六十年
3、代，得利于花粉小孢子培养和原生质体培养的成功。和植物组织培养的历史相比，中国的在这方面的研究起步算是比较早的，在二十世纪四十年代在这方面就有所研究，但是大范围的发展起来还是始于二十世纪七十年代的花药培养。植物组织培养的概念 是指在人工控制的条件下，将植物体的任何一部分，或器官、或组织，或细胞，进行离体培养，使之发育形成完整的植物体。所谓人工控制的条件，即营养条件和环境条件；植物体的任伺一部分是指根、茎、叶、花、果以及它们的组织切片和细胞。它的优越性在于：可以在不受其他部分干扰的情况下研究被培养部分的生长和分化规律。特点是：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁
4、殖率高；管理方便，利于自动化控制。植物组织培养的理论基础 是植物细胞的全能性（totipotency） 。一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成完整植株，这就是所谓的细胞全能性。植物组织培养的基本方法 是材料选择、培养基配置、接种与培养和最后的小苗移栽。植物组织培养的应用 1、植物离体快速繁殖2、植物脱毒苗木培育3、植物新品种培育4、植物次生代谢产物生产6、人工种子5、植物种质资源的离体保存5国内外研究进展 1 植物组织培养的光源研究 早在 1991 年， 维斯康星大学的 Bula 等利用以红光 6
5、60 nm 为发光中心的 GAALAS LED 阵列及其辅助光蓝色荧光灯， 栽培了 GRAND Rapids lettace（lactucasativa L） ， 这大概是世界上最早利用 LED 作为光源进行植物栽培的试验实例。经 LED 光源处理的组培苗鲜重增量、碳酸酐酶活性以及叶绿素含量等明显高于对照的日光灯处理组培苗。2 无糖组织培养技术研究 无糖组织培养是日本千叶大学古在丰树教授研究开发的一种新的植物组培技术。他首先研究发现容器中的小植株也具有光合自养能力， 从而考虑改变植株的营养方式以 CO2 作为植株的碳源， 同时改善植株的生理和能量代谢，使植株更好地发挥自身的光合能力，降低生产成
6、本。3 植物组织培养的新型培养容器研究 在传统的组织培养中， 通常采用容积较小的培养容器以降低培养基中糖引起的污染， 一般情况下容器中的空气流动性差，相对湿度高，CO2 浓度低。为了增强培养容器内外的气体交换、降低容器内的相对湿度， 近年来有不少学者研究了利用高分子膜材料制成的培养容器的有效性。1.实验材料材料：在武汉大学某花鸟市场购买的菊花，菊花花瓣呈白色，取里层花瓣切块后接种于平底试管。2.菊花的外植体的制备2.1 药品：0.1mg/ml NAA,1mg/ml 6-BA,储备液 MS 培养基及其储备液(mg/L) 全班分小组配制储备液量:1L; 2 L; 200ml; 200ml62.2
7、灭菌物品:平底试管 9 支,蒸馏水 200ml,解剖刀一把,镊子一把,平板 9个,一套枪头。其他器材: 酒精灯,打火机,废液缸,移液枪一套,篮筐，棉塞，棉线，超净台，称量纸，锥形瓶 250ml，玻璃棒，报纸。2.3 方法: 2.3.1 MS 培养基的配制：先称取琼脂 1.4g，蔗糖 6g 于 250ml锥形瓶中，再加 150ml 蒸馏水，讲锥形瓶在电炉上加热溶解。溶解后在锥形瓶中加储备液10ml，储备液1ml，储备液1ml，储备液1ml，然后加水到200ml，用 HCl 或 NaOH，调 PH 至 5.8。最后趁热分装于 9 支平底试管，棉塞封培养基 储备液NH4NO3 1650 33000K
8、NO3 1900 38000CaCl2.2H2O 440 8800MgSO4.7H2O 370 7400KH2PO4 170 203400KI 0.83 166H3BO3 6.2 1240MnSO4.4H2O 22.3 4460ZnSO4.7H2O 8.6 1720Na2MoO4.2H2O 0.25 50CuSO4.5H2O 0.025 5CoCl26H2O 0.0252005FeSO4.7H2O 27.8 5560Na.EDTA.2H2O 37.3 200 7460肌醇 100 20000烟酸 0.5 100烟酸吡哆醇 0.5 100盐酸硫胺素 0.1 20甘氨酸 22004007口。2.3
9、.2 灭菌: 用高压蒸汽灭菌锅将上述物品灭菌,在 121灭菌 15min。2.3.3 加激素和外植体的消毒： 在超净工作台上，趁热在每支试管加 20ul 6-BA 和 20ul NAA，取菊花花瓣,用自来水洗 2-3 次，置于小烧杯中，用体积分数为 70%的乙醇浸泡 15-30s。用无菌水清洗 2-3 次后，用质量分数为 2%的次氯乙酸钠液中浸泡 6-10min，用无菌水洗 3-4 次。于灭菌过的培养皿上切成0.50.5 大小的方块。接种到平底试管诱导培养基中。2.3.4 菊花花瓣接种： 插入菊花瓣,要注意使花瓣的形态学下端接触到培养基.每瓶接种 5 瓣,接种后将锥形瓶的瓶口在酒精灯火焰处转动
10、灼烧一遍。重新包扎封口，贴上标签。2.3.5 培养： 将接种后的 9 支平底试管放在 30恒温室培养。20 天左右就可以形成愈伤组织。2.4 后续： 收拾台面，处理废弃物。3.菊花的分化培养3.1 试剂： 6-BA 1mg/ml,NAA 0.1mg/ml,储备液 3.2 灭菌的物品： 平底试管 9 支,蒸馏水 200ml,解剖刀一把,镊子一把,平板 9 个,一套枪头。其他器材:酒精灯,打火机，用镊子，废液缸,移液枪一套, 篮筐，棉塞，棉线，报纸，超净台，称量纸，锥形瓶 250ml，玻璃棒。3.3 方法： 3.3.1 MS 培养基的配制：先称取琼脂 1.4g，蔗糖 6g 于 250ml锥形瓶中，
11、再加 150ml 蒸馏水，讲锥形瓶在电炉上加热溶解。溶解后在锥形瓶中加储备液10ml，储备液1ml，储备液1ml，储备液1ml，然后加水到200ml，用 HCl 或 NaOH，调 PH 至 5.8。最后趁热分装于 9 支平底试管，棉塞封口。3.3.2 加激素和分化： 在无菌操作室中, 趁热在每支试管加20ul 6-BA 和 20ul NAA。然后用镊子取出图 4 中的愈伤组织，在平板上，用灭菌的蒸馏水清洗三次。用小刀切成 55mm 的小块，用镊子放入平底试管里。立8即在酒精灯火焰处灼烧管口后塞上棉塞，报纸包扎标记。3.3.3 培养： 将 9 支平底试管放在 20培养室，光照下培养，直到发芽。3
12、.4 后续： 收拾台面，处理废弃物。4、菊花的生根培养4.1 试剂： NAA10mg/ml,储备液 4.2 灭菌物品: 蒸馏水 200ml,解剖刀一把,镊子一把,平板 9 个,一套枪头。其他器材: 酒精灯,打火机,废液缸,移液枪一套, 篮筐，棉塞，棉线，超净台，称量纸，锥形瓶 250ml，玻璃棒，报纸。4.3 方法：4.3.1 MS 培养基的配制： 先称取琼脂 1.4g，蔗糖 6g 于 250ml锥形瓶中，再加 150ml 蒸馏水，讲锥形瓶在电炉上加热溶解。溶解后在锥形瓶中加储备液10ml，储备液1ml，储备液1ml，储备液1ml，然后加水到200ml，用 HCl 或 NaOH，调 PH 至
13、5.8。最后趁热分装于 9 支平底试管，棉塞封口。4.3.2 加激素和分化： 在无菌操作室中, 趁热在每支试管加1.8ul NAA。然后用镊子取出愈伤组织，在平板上，用灭菌的蒸馏水清洗三次。用镊子放去平底试管里。立即在酒精灯火焰处灼烧管口后塞上棉塞，报纸包扎标记。4.3.3 培养： 将 9 支平底试管放在 20培养室，光照下培养，直到发芽。4.4 后续： 收拾台面，处理废弃物。5、菊花的移植5.1 讲生根培养基里面的菊花一直到寝室花盆。5、结果与讨论5.1 图片结果95.1.1 菊花的诱导培养基 20 天后图 1 图 2 图 3图 4 图 5 图 6图 7 图 8 图 910从上图中可以发现图
14、 5、6、9 中的愈伤组织完全死亡，无明显现象。图2、3、6、7、8 其他的生长良好,其中夹带着少许绿色组织，生长较为缓慢。而图 4 则生长旺盛，脱分化出大量的愈伤组织，呈一团浓绿组织。5.1.2 菊花的分化组织基 30 天后图 10 图 11 图 12可以清晰看出与 10、11 中的菊花分化组织生长良好,能够看到有少许的小叶片.图 12 试管中的菊花组织上有大量褐化的成分，颜色较淡。5.1.3 菊花的生根培养基图 5 图 6从图 5、6 中可以清晰的看到有许多大叶片，在底部有少许根毛出现。确11定生根培养良好,可以移植在花盆。52 讨论 5.1.1 可以在实验里看到了一些组织出现了褐化现象,
15、其中褐变是指在组织培养过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也慢慢变褐而死亡的现象。考虑到实验过程,可以发现距阿华的褐化现象可能是以下的几个方面造成的： （2）菊花的生理状态 菊花的状态不同，接种后褐变程度不同。一般菊花的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变，成龄材料一般均比幼龄材料褐变严重。（4）培养基 在初代培养中，培养基中无机盐浓度过高，会引起酚类物质大量产生，导致褐变。（5）光照 在采取菊花前，将接种后的初代培养的菊花在黑暗条件下培养，对抑制褐变发生也有一定的效果遮光抑制褐变的原因主要是由于氧化过程中，许多反应受酶系统控制，而酶系统活性受
16、光照影响。但是，暗培养时间过长会降低外植体的生活能力，甚至引起死亡。（6）温度 高温促进酚氧化，培养温度越高，褐变越严重，而低温可抑制酚类化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐变。在实验途中可以有几支试管倾倒在日光灯管上，造成了温度过高。（7）培养时间 材料培养时间过长，会引起褐变物的积累，加重对培养材料的伤害。菊花随着培养时间的延长，褐变程度会加剧，甚至在超过一定时间不进行转接，褐变物的积累还会引起培养材料的死亡。从可以的实验时间来看，可以的菊花的培养时间还不是很长，这个原因应该说是影响不大的。6.实验建议: 6.1 实验注意事项： 1. 无菌操作是最为关键的，预备室的清洗、培养基的配
17、制和灭菌，外植体初步处理和接种等工作要灭好菌。2.培养室要求光照、温度控制，以利于外植体的生长、发育。3.在菊花组织培养中试剂的配制配方要熟记，避免不必要的错误。126.2 在实验过程中老师可以控制每组的激素添加量，让全班一个大组的激素添加量形成交叉，能够横竖来比较。因为我感觉在此次实验 中，大家试管的成功率不是很理想。参考文献: 1 植物组培网 http:/ 李浚明组织培养教程 20023 期刊论文 曾凡力.ZENG Fan-li 菊花花瓣的组织培养 -北方园艺 2007。4 邹英宁，李国怀李组织培养研究进展(综述)J亚热带植物科学，2005，34(4)：7680.5 期刊论文王康才.张雪琼.茅毓英杭菊花花瓣组织培养 -中草药 2000,31(8)
