1、食品卫生微生物学检验三,菌落总数测定之二： 菌落计数的报告 大肠菌群测定之二： 产气的发酵管转种伊红美蓝平板和EC肉汤。 实验流程： 平板菌落计数报告菌落总数。 产气的乳糖胆盐发酵管伊红美蓝平板分离单菌落、接种EC肉汤。,菌落总数的检验程序 检样 做成几个适当倍数的稀释液 选择2个3个适宜稀释度 各取1ml分别加入灭菌培养皿内 每皿内加入适量营养琼36148h2h 菌落计数 报告,25ml,1ml,1ml,225ml生理盐水,稀释倍数：101 102 103,菌落数：多不可计 164 20,1641021.64104 CFU/ml,待测样品,15ml培养基,9ml生理盐水,1ml2个 1ml2
2、个 1ml2个,菌落总数,依据检验规范中检验菌落总数的条件,不能检测出检样中实际的活菌数，所获得的结果必然低于实际存在的活菌数，且琼脂平板上出现的菌落不一定都是单个微生物形成的，可能由多个微生物分裂繁殖堆积而成，所以不宜报告为细菌总数、霉菌或酵母菌总数，而应报告单位重量、容积、表面积或体积内菌落形成单位（colony forming units CFU）。,菌落总数是用来判定检样被细菌污染程度的指示菌。不能表明污染菌的种类和来源。 菌落总数虽然不能直接说明是否有致病微生物存在，但菌落总数常与污染程度平行。 菌落总数的卫生学意义： 判定检样被微生物污染的程度。 某些样品的卫生限量标准。 预测食品
3、存放的期限。,检测菌落总数注意事项,菌落计数时,先分别观察不同稀释度的2个平板内菌落的生长情况。平行检测的2个平板上生长的菌落数应该接近,不同稀释度的几个平板上的菌落数应与检样稀释倍数成反比,即检样稀释倍数越大,菌落数越少。 如果所有平板上都菌落密布,不要用“多不可计”报告结果,而应在稀释度最大的平板上,任意数其中2cm2内的菌落数(n), 代入圆面积公式求出。报告结果时,应在菌落计数前加上“估计”二字。 “估计”菌落数为: (n/2)r2稀释倍数,7.2 菌落计数方法 平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同一稀释度的各平板平均菌落总数。 7
4、.3 菌落计数的报告 7.3.1 平板菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。 一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。 平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。,7.3.2稀释度的选择 应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（例1）。 若有两上稀释度，其生长
5、的菌落数均在30300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数（例2）；若大于2则报告其中较小的数字（例3）。若所有稀释度平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（例4） 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（例5）,若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（例6） 。 若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（例7） 。 7.3.3 菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告
6、，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。,一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系,水的类别 菌落总数(cfu/ml) 最清洁水 10100 清洁水 1001000 不太清洁水 100010000 不清洁水 10000100000 极不清洁水 100000 我国规定生活饮用水卫生标准为1ml水中的菌落总数不得超过100个（100cfu/ml）。,大肠菌群检验程序 检样稀释乳糖胆盐发酵管, 361， 24h2h 不产气 产气 大肠菌群阴性 伊红美蓝琼脂平板,361，24h2h 报告 革兰染色 乳糖发酵管,361
7、，24h2h 革兰阳性 革兰阴性无芽胞杆菌 产气 不产气 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 大肠菌群阴性 报告 报告 报告,待测样品,225ml生理盐水,10ml乳糖胆盐发酵管,25ml,1ml,1ml,稀释倍数：10-1 102 103,1ml3支,1ml3支,1ml3支,9ml生理盐水,大肠菌群与粪大肠菌群,大肠菌群是指需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸又产气的革兰阴性无芽胞杆菌（包括大肠埃希菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属）。 食品卫生意义：作为粪便和肠道致病菌污染食品的指示菌。 我国生活饮用水卫生标准：每100ml中不得检出大肠菌群。 粪大肠菌群为大肠菌群的一个亚种,直接来自粪便，
8、欧洲国家称为“耐热大肠菌群”，用提高温度的试验方法（44.5培养24h），可以将粪大肠菌群从总大肠菌群中区分开。,粪大肠菌与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，粪大肠菌群的存在,可认为食品直接或间接地受到了比较近期的粪便污染。 粪大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒的可能性更大。 粪大肠菌群比大肠菌群能更贴切地反应食品受人和动物粪便污染的程度，且检测方法比大肠菌群简单而受到重视。 检验“粪大肠菌群”注意事项: 将接种好的样品放入恒温水浴箱或隔水式恒温培养箱时,其箱内温度一定要求达到所要求的温度(4
9、41)时,方可放入。如用恒温水浴箱，其水面要高于接种物面。,产气量与小倒管,在乳糖胆盐发酵中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡，有时可以看到沿管壁缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可使发酵倒管全部充满气体，少者可产生比小米粒还小的气泡。 如果对产酸未产气的乳糖发酵有疑问时，可以用手轻轻拍动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。,初发酵和证实试验,无论是国家标准的三步法，还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸又产气”。 初发酵阳性管，不能肯
10、定就是大肠菌群阳性，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差比较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。,分离培养接种阳性试管的选择,假如只接种3个10 ml样品时,所有产酸产气的管都做分离培养。 假如接种12支管,那就要选所有各管都阳性的最小样品量。 例如经培养后,10ml，1ml，0.1ml各3管，0.01ml 2管,均呈阳性结果(3-3-3-2),选择MPN编码为3-3-2,分离培养做原来接种量为1ml，0.1ml和0.0 1ml的阳性管。,510mm2,30条线/区,平板划线不少于150条线,注：井水万倍稀释，奶茶、豆浆千
11、倍稀释。,注：井水万倍稀释，奶茶、豆浆千倍稀释。,注：录入、保存结果，待第5次课分析。,注：录入、保存结果，待第5次课分析。,实验内容,菌落总数测定P11 ：菌落计数,按组号顺序报告CFU。 大肠菌群测定P17 ：接种伊红美蓝平板，分离单菌落（每人1块平板）将产气的发酵管摇均匀，用接种环取菌液，在平板表面上方密集涂布5-10mm面积。烧掉接种环上多余的标本。采用5区划线法，通过密集涂布部分1-3次，然后在平板表面，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，线段要划得长而密集，五区划线不少于150条。接种环烧灼灭菌，平板作标记，以组为单位，集中培养。 粪大肠菌群测定P17 ：产气的发酵管转种EC肉汤(每人1支，标记)44.5培养24h。,思考题,可作为菌落总数测定标准的平板，其菌落数应选择多少？ 菌落总数的卫生学意义？ 在大肠菌群检测工作中，为什么必须做证实试验？ 采用什么方法，可以区分“大肠菌群”与“粪大肠菌群”？ 大肠菌群的食品卫生意义？,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接种针,第2列放置 接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,实验室器材 整齐有序,
