1、基因工程原理 principles of gene engineering,生物工程学院,吴兴泉 河南工业大学生物工程学院生物技术系 ,第一章 基因工程概况,一.基因工程含义 按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术在较短时间内有目的地改造生物种性或生产生物产品，创造出更符合人们需求的新的生物类型。,1.1 引言,例如： 黑曲霉的纤维素酶基因转入酵母，使酵母可降解纤维素，利用秸杆发酵生产酒精。,优点 打破物种界限，使遗传信息在不同物种间进行重组和转移。,例如： 黑曲霉的纤维素酶基因转入酵母，使酵母可降解纤维素，利用秸杆发酵生产酒精。,再例如,第一个转基因动物是 1982
2、出生的小鼠。 它被转入了大鼠的生长激素基因，结果长的与大鼠一样大。,转基因小鼠,正常小鼠,转入绿色荧光蛋白基因的小鼠在暗背景下可发出绿色荧光。,中国科学家将人的岩藻糖转移酶基因转入奶牛，获得的转基因牛于2003出生, 其牛奶中含有岩藻糖转移酶，可用于治疗胃病。,二、基因工程的理论基础,1、不同基因具有相同的物质基础 几乎所有的生物的各种各样的基因都是由具有一定功能和核苷酸序列的DNA片段组成。 DNA都是由四种核苷酸组成 核苷酸是由磷酸、五碳糖和四种咸基组成 DNA的二级结构都是双螺旋结构.,2、基因是可切割的 基因可被限制性核苷酸内切酶切开。,5 ATCGCGATGGATCCGCGAT 3
3、3 TAGCGCTACCTAGGCGCTA 5,3、基因是可以转移的. 基因可在不同染色体、细胞和物种间转移。,4、多肽与基因之间存在对应关系。 有一条多肽就有一种相对应的基因，基因序列决定多肽的序列，通过多肽链可推导基因的有无。,5、遗传密码的通用性 允许其在不同生物中表达。可以人工合成。,6、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。,三、基因工程的基本技术路线,克隆载体,受体细胞,重组DNA,克隆,转基因生物,生物材料,mRNA,DNA,RNA,文库,基因组文库,人工合成,目的基因,病毒,黑曲霉基因组DNA,Cycle Plasmid DNA of bacteria,限制性内切酶,DNA连
4、接酶,纤维素酶基因,纤维素酶基因,DNA重组技术,PCR DNA聚合酶,限制性内切酶,Cycle Plasmid DNA vector,线性化后， 转入酵母,酵母可产生纤维素酶，遗传性状发生改变。,1 准备阶段 1944，Avery 证明DNA是遗传物质，是基因的载体. 1953, Watson and Crick: 证明 DNA 的双螺旋结构. 1958-1971, 提出中心法则，破译遗传密码60s-70s, 发现核苷酸内切酶和DNA连接酶，质粒被用做载体进行基因转移。,四、基因工程简史,2 基因工程的问世1973年，Cohen将非洲爪蟾核糖体基因与质粒pSC101 重组转入 E. coli
5、., 并证明该基因可转录。,3 基因工程的发展 在近40 的时间里，基因工程飞速发展. 3.1建立了一整套相关技术: 例如： 体外扩增基因片段：Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA的体外重组技术 细菌、动植物基因转化技术等,3.2 获得了一系列的基因转化载体 :例如：各种质粒，病毒载体等 3.3 获得了大量转基因生物. 转基因细菌 (E.coli. ) 转基因动物 (mouse, cow, sheep, pig) 转基因植物( tobacco, potato, tomato, cotton,rice),1.2 基因工程的研究内容,一、基础研究 1、克隆载体的研
6、究构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节。bacteria ：plasmid vector(质粒)plant ：Ti plasmid vector（Ti质粒)animal ：animal virus vector（动物病毒）,2、基因工程受体的研究受体 (receptor)：基因转化的对象 Bacteria : 大肠杆菌（E.coli）、蓝细菌 (cyanobacteria ) Fungi :酵母菌 (yeast)单细胞的Plant:愈伤组织(callus), partial tissue or organAnimal :生殖细胞(reproductive cell),胚细胞(embryo
7、blast)、体细胞( body cell）,3、目的基因目的基因：基因工程研究开发的可满足人们特殊需要的基因产物。 （1）目的基因主要三种： 药物相关基因（胰岛素） 植物抗逆基因：抗虫、抗病、抗逆境，Bt gene 抗虫基因） 具有特殊营养价值的基因,（2）获得目的基因的方法: 构建和筛选基因组文库(Genome library) 构建和筛选cDNA文库(cDNA library) 人工合成：例如采用 PCR技术,4、工具酶用于合成、切割、连接、修饰DNA片段的酶 。 种类 DNA聚合酶 DNA polymerase, 限制性内切酶 Restriction endonuclease, 连接酶
8、 DNA ligase, 修饰酶 Modification enzyme,(1) DNA 聚合酶：合成 DNA 片段Such as : Taq DNA polymerase (2) 限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease） ： 基因工程中的关键酶， 可有规律的切割DNA片段EcoR I 5ATCGCGAT GAATTCGCGAT 33 TAGCGCTACTTAAGCGCTA 5BamH I 5ATCGCGAT GGATCCGCGAT 33 TAGCGCTACCTAGGCGCTA 5,(3) DNA连接酶用于连接各种DNA片段，使不同基因重组. 例如：T4 DNA 连
9、接酶,(4) 修饰酶：用于DNA的修饰。 例如： 碱性磷酸酯酶 末端脱氧核苷酸转移酶 核酸外切酶。,5、基因工程新技术研究 (1) 转基因方法: 质粒转化 病毒转导 基因枪 电穿孔仪 种质介导法 (2) 检测方法 分子杂交 PCR 基因芯片技术,(3) DNA合成方法PCR技术的改进（长片段PCR、RT-PCR等） (4) 基因片段的分离 凝胶电泳技术（脉冲电泳技术）,二 、应用研究,（一） 药物相关基因最活跃发展最快的领域 主要种类有： 活性多肽 疫苗 DNA药物,1、活性多肽,种类： 干扰素、胰岛素、白介素，生长因子等。 用途 诊断、预防和治疗疾病 干扰素：干扰病毒复制，广谱抗病毒活性和免
10、疫调节功能 胰岛素：治疗糖尿病， 白介素：治疗多种实质性恶性肿瘤。,生产方法：传统方法：培养动物，从中分离基因工程方法：克隆基因转入细菌基因表达 -纯化蛋白,2、 疫苗,诱导免疫反应. 传统生产方法 ：灭活或减毒的病原物。 缺点：有不良反应。 基因工程方法 ： 去除有毒基因，根本解决致病性 可食疫苗。,3、 DNA药物,作用方式： 重组DNA药物并转入病变组织、细胞，发挥作用治疗基因缺陷。 药物蛋白基因转入病人体内表达后发挥作用。 DNA插入异常表达基因使其失活。,DNA药物的生产方法：转基因微生物发酵培养转基因动物细胞培养利用转基因动物的乳腺生产,（二）转基因植物 1、转化方法： 农杆菌介导
11、法 枝接转化法：基因枪、电穿孔、聚乙二醇法 2、受体细胞 愈伤组织(Callus) ,叶片, Protoplast(原生质体)种质系统的基因转移：子房注射、花粉管通导等。,3、转入的基因 抗病基因 抗病毒（病毒的外壳蛋白基因，烟草、马铃薯、大豆等） 抗细菌、抗真菌（从抗病品种中克隆抗病基因转入感病品种，抗白粉病、赤霉病的小麦）,抗虫基因 苏云金杆菌的Bt杀虫晶体蛋白基因。抗虫棉花、烟草、马铃薯水稻等。 抗除草剂方面如抗草甘磷的大豆。抗除草剂机理：改变除草剂靶物的敏感性；转入解毒基因。,抗逆境基因抗旱、抗涝、抗寒、抗热和耐盐等 改善作物品质如改善作物蛋白质、克隆与淀粉、脂类合成相关的基因。 生物
12、药物如疫苗、活性多肽的香蕉、番茄等。,（三） 转基因动物,目的：改进生产性状 例如：使家畜长的更大、 奶牛产奶更多。,（四）其它方面,酶制剂工业目前蛋白酶、淀粉酶基因已转入E.coli. 并可E.coli.中生产。保护环境：制造可降解污染物的微生物。“超级菌”、 “超级质粒”：辛烷、已烷和癸烷、二甲苯和甲苯、樟脑、萘，石油中的烃类化合物、重金属、致癌物、农药和杀虫剂,食品工业：食品酶的生产 化学工业：转基因微生物生产化工产品：乙醇、丙酮、甘油. 能源工业: 生物柴油、燃料乙醇的生产。,1.3 基因工程的安全性问题,转基因：宠儿 还是孽种？ 不同地区态度不同： 美国: 不能证明它危险，就不应该限制 . 大力发展、始终处于领先地位 欧洲： 不能证明它不危险，就应该限制 ； 多年的追求；一旦实现又无法消受,转基因产品是否对人有害? 尚无明确答案. 目前尚无转基因产品对人造成危害的实例.1993年基因工程安全管理办法，1996年农业生物基因工程安全管理实施办法，2001年农业转基因生物安全管理条例对基因工程操作的各个环节做出严格规定。,1.4 基因工程研究发展前景,前景： 具有巨大的活力，前景不可限量。各国决策者均从战略上拟定宏伟的基因工程相关产业的发展计划。 研究方向 基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面。,
