1、基因工程,黄欣媛 ,基因工程与其它课程的关系 基因工程是生命科学各专业中的一门非常重要的专业基础课或专业课。 分子生物学、遗传学、生物化学、微生物学是该学科的基础。 基因工程的发展也渗透到生命科学的各领域，促进各学科的发展。,基因工程总目录,第一章 基因工程概述 第二章 基因工程的载体和工具酶 第三章 基因的常规技术 第四章 基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达 第五章 转基因植物 第六章 转基因动物 第七章 基因治疗（选讲、自修） 第八章 蛋白质工程（选讲、自修）,考核方法,平时成绩30%,闭卷考试 70%,名词解释,出勤课堂 课堂表现 小综述,填空题,选择题,100%,判断题,问答题,主要参考
2、资料,张惠展等.基因工程(第2版).高等教育出版社 吴乃虎等. 基因工程原理.科学出版社。, 生物技术通报 中国生物工程杂志 农业生物技术学报 生物工程学报 生物技术 遗传, Molecular genetics and genomics Animal biotechnology Nature genetics Plant cell Science Nature,小综述推荐内容和写作要求,1. 每人从中任意选择一个大题目（也可以自己另选一个题目），或在大题目下自己立一个分题目，但不能与其他人重复。,2. 每个题目都要写出原理、产生、发展历史、现状、发展趋势、理论或实践意义。,3. A4纸打印。
3、,推荐小综述题目,1. 单色和多色荧光原位杂交（FISH）,2. RNA干扰（RNAi）及其应用,3. 生物芯片（chip）,4. 基因扩增（PCR）,5. 基因库（gene bank）及序列的查询和分析,6. DNA测序,7. 酶联免疫吸附测定（ELISA）,8. 遗传病的基因治疗,9. 噬菌体展示 （phage display）,10. 酵母双杂交及其衍生系统,11. 基因疫苗,12. 基因打靶 （gene targeting),13. 随机多肽文库（RPLs）,14. 转基因植物,14. 转基因植物,15. 转基因动物,16. 定点突变,17. 细菌表面呈现（Bacterial surf
4、ace display）,18. 动物克隆,19. 胚胎干细胞（ESC）,21. 内含肽（intein）及其应用,20. 差异显示,22. 限制性内切梅,23. 基因工程载体,24. 生物软件及其使用,25. 基因工程相关的网站,26. 人类基因组计划（HGP）,27. 基因工程产物的纯化策略（载体）,28. 基因工程对中国经济的影响,30. 基因工程的社会安全及伦理问题,29. 发达国家中的基因工程发展及现状,31. 制作基因工程网站,32. 目前流行的传染性疾病的基因工程治疗思考,33. 核糖体展示技术（ribosome display）,第一章 基因工程概述,1.1 基因工程的发展简史,
5、在分子水平上，提取或合成不同生物的遗传物质，在体外进行切割、再和某一载体进行拼接重组，然后再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。 简单说：指异源重组DNA在受体细胞的扩增与表达。,DNA重组、扩增、表达是其三要素。,一、基因工程的概念,生物工程 biological engineering 遗传工程 genetic engineering 基因工程 gene engineering 分子克隆 molecular cloning 基因克隆 gene cloning 基因操作 gene manipulation 重组DNA技术 recombinant DNA tec
6、hnique,基因工程(gene engineering) 常和以下名称混用:,基因工程的诞生和发展,泛基因阶段1,顺反子阶段4,摩尔根的基因阶段3,孟德尔遗传因子阶段2,现代基因阶段 5,基因 的研究,Mendel G.J. (1822-1884). 1856-1864豌豆杂交实验。,2. Mendel的遗传因子阶段,1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律 1900年Mendel遗传规律被重新发现。遗传学的元年,Mendel提出：生物的某种性状是由遗传因子负责传递的。是颗粒性的，体细胞内成双存在，生殖细胞内成单存在。遗传因子是决定性状的抽象符号。,孟德尔分离律,孟德尔自由组合律,黄圆
7、 绿圆 黄皱 绿皱,1909年丹麦遗传学家Yohannsen (1859-1927) 发表了“纯系学说”首先提出了“基因(gene)”的概念，代替了Mendel “遗传因子” 的概念。但没有提出基因的物质概念。,3. Morgan的基因阶段,显微镜技术与染色技术的发展，使人们注意到，细胞分裂时，尤其是减数分裂中，染色体的行为和孟德尔提出的等位基因的分离规律相当一致，所以，确定基因在细胞核中，在染色体上。,1910年，Morgan T.H.等以果蝇为研究材料，提出了基因的连锁遗传规律。说明了基因是在染色体上占有一定空间的实体。基因不再是抽象符号，被赋予物质内涵。,连锁遗传规律的提出,同源染色体分
8、别带着控制,同一性状的两个等位基因,显性等位基因 纯合子,隐性等位基因 纯合子,杂合子,4. 顺反子阶段,1957年，本泽尔(Seymour Benzer)以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）概念。 顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1条多肽链。,5.现代基因阶段,1）操纵子 （启动基因操纵基因结构基因）,2）跳跃基因 指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方，它们能从1个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个位置。 3）断裂基因1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为断裂基因。
9、4）假基因 不能合成出功能蛋白质的失活基因 。 5）重叠基因 不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的 即重叠的。 现代对基因的定义是：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。,基因的特点 :不同基因具有相同的物质基础 基因是可以切割的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,二、基因工程诞生的理论基础,1 . DNA是遗传物质,1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。,1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。,（1）肺炎双球
10、菌转化实验,（2）噬菌体转染实验,1928年，英国微生物学家F. Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。（1）S型：注射小白鼠，死亡。（2）S型，65 加热：注射小白鼠，活。（3）R型：注射小白鼠，活。（4） 65 加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。,40年代，DNA是遗传物质被证实1944年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。（1） S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；（2）经DNase 处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。（3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。不仅证实
11、了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。,1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。,2. DNA双螺旋结构,50年代，DNA的双螺旋模型的提出 和DNA复制机理的阐明,DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。1953年，Francis Crick和James Watson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随
12、后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。,分子遗传学的诞生,1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”,DNA,RNA,protein,1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码,3. 中心法则和遗传密码,原核生物的基因调控操纵子模型,1961年，Jacques Monod和 Fancois Jacob提出了原核基因调控的 操纵子模型 （operon model）。,三、基因工程诞生的技术突破,1. 限制性内切酶（restriction endonucleases）,1970
13、年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber 理论预见限制酶,Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断,Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶,1978年Nobel生理或医学奖,2. DNA连接酶（ligase）,1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。,3. 载体（vector）,1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。,4. 感受态体系,1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌
14、同样能吸收质粒DNA。,5. 琼脂糖凝胶电泳,1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。,6. DNA测序技术,1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。,1980年Nobel化学奖,四、基因工程的诞生,1980年Nobel化学奖,1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：,1. Berg的开创性实验,将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来。,2. Boyer-Cohen实验,1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一
15、种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。,Boyer-Cohen实验,Stanley Cohen 1986 Nobel 生理或医学奖,Herb Boyer,外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。,1. 跨物种性,2. 无性扩增,外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。,五、基因工程的特征,2. 重组体的制备,六、基因工程的主要操作内容,1. 目的基因的获取,从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的
16、DNA片断。,将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。,将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。,4.克隆鉴定,3.重组体的转化,挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。,5.目的基因表达,使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。,基因工程的基本流程,基因分离酶切,载体酶切,基因和载体连接,导入细菌,重组质粒繁殖,重组克隆的选择,序列分析和基因表达等研究,52,基因工程的基本过程,酶切 连接,载体,目的基因,重组子,宿主细胞,选择、筛选,目的基因扩增,转化或转染,目的基因表达,导入,表达体系,基因工程研究的基本技术路线,1.2 基因工程的兴起
17、,1977年，激素抑制素的发酵生产成功。 1978年， Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。 1979年， Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。 1980年， Nagata等， 遗传工程菌生产干扰素获得成功。 1981年， 用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。 1982年， 重组DNA技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产。 1983年， 基因工程生产狂犬病疫苗取得突破型进展。,1997年，动物基因工程产品销售额约,1.8亿$,转基因小鼠,人类秃顶,Nature Biotechnology, 1999,17(1
18、):9,转基因家蚕,防弹衣,Nature Biotechnology, 1999,17（5）：412,83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02,First transgenic plant,Delay-ripening tomato Commercialized in the US,First field tests,Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized,GM maize approved by EU,First Bt corn pla
19、nts,Rotting resistant tomato approved by FDA,植物基因工程的发展迅速,植物转基因育种的发展优势,1、扩大了作物育种的基因库 2、提高了作物育种的效率 3、减轻了农业生产对环境的污染 4、拓宽了作物生产的范畴,全球转基因作物种植面积（百万公顷）,全球转基因作物导入特性比例,全球不同转基因作物和应用面积,全球转基因作物销售收入（亿美元）,植物基因工程研究,植物基因组计划,植物分子育种,高产、优质、高效和多抗性,植物作为反应器,香蕉、马铃薯、番茄等,玉米、棉花、大豆、高粱和番茄,酒精、石油、工业酶等,我国基因工程部分研究进展,转基因抗病虫植物 我国科学家将
20、抗虫基因导入棉花，获得了抗虫植株，对棉蛉虫的抗虫效果十分显著，现正进行田间加代繁殖。抗黄矮病、赤霉病、白粉病转基因小麦和抗青枯病马铃薯也已研究成功，开始田间加代繁殖。 基因工程疫苗 乙型肝炎是危害我国人民健康的严重疾病，我国乙肝病毒携带者1亿 1千万人，其中40左右的慢性肝炎可能发展成为肝硬化和原发肝癌。以往乙肝疫苗是从人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不仅有巨大的经济效益，而且有巨大的社会效益。基因工程乙肝疫苗是我国正式批准投放市场的第一种高技术疫苗，在20多项指标上达到国际先进水平，获国家科技进步一等奖。继乙肝疫苗之后，我国又研制成功了痢疾、霍乱等数种基因工程疫苗，并经国家批准进入
21、临床试验。,基因工程药物 干扰素是一种广谱的抗病毒和抗肿瘤高技术药物，对防治病毒性肝炎和恶性肿瘤有重要的作用。现已有了3个品种的基因工程干扰素获得国家新药证书，开始大批量生产。除此之外，我 国还研制成功了肝癌导向药物（生物炸弹）、系列恶性肿瘤辅助治疗药物等十余种基因工程药物，有些已获试生产文号或进入中试开发阶段。 动物克隆和转基因研究 2003年10月16日，“神舟”五号成功着陆的同一天，包括两头转基因体细胞克隆牛在内的10头体细胞克隆牛现身山东梁山县。我国转基因体细胞克隆技术及体细胞克隆技术的研究与应用达到国际前沿水平。3月25日出生的体细胞克隆牛“乐娃”，由于成功地转入了绿色荧光蛋白基因，
22、成为我国首例转基因体细胞克隆牛，标志着我国在转基因体细胞克隆技术方面的新突破。,制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。,1. 对环境的影响,2. 新型病毒的出现,重新组合一种在自然见尚未发现的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。,一、基因工程的安全隐患,1.3 基因工程的安全性,将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。,4. 人造生物扩散,新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。,3. 癌症扩散,1. 公众的担忧,二、重组DNA研究的安全准则,1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重
23、组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。,1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。,这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。,2. 专家的态度,3.制定安全规则,1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。,规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以
24、及禁止若干类型的实验。 1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。,分4级：P1P4级。,（1）实验室的物理安全,4. 基因工程的安全措施,一般装备良好的普通微生物实验室。, P1级实验室, P2 级实验室,在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。,全负压的实验室，同时装备安全操作柜。, P4级实验室,专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。 具有最高安全防护措施。, P3 级实验室,在自然环境中无法存活。,（2）实验室的生物安全,分3 级（大肠杆菌）：EK1EK3级。, EK1级的大肠杆菌,在自然环境中一般都要死亡。, EK2-EK3级大肠杆菌,第一
25、个“安全”菌株是K12（1976年），很不实用，已淘汰。,（3） 载体的安全,应该是失去了自我迁移的能力。,不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。 （容易构建）。如pMB9，pBR322等。,一、基因工程在农业生产中的应用,1. 提高植物的光合作用效率,1.4 基因工程的应用,改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。,（1）提高CO2的固定率,改变光能交换系统的分子的基因结构。,（2）提高光能吸收率和转化率,使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。,2. 提高豆科植物的固氮效率,是农业生物技术的主要内容。 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优
26、质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。,3. 转基因植物,世界各国转基因作物大田释放情况（1987.1-1998.4）,中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）,将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。 使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。,4. 转基因动物,在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物（TPA）和尿激酶的转基因小鼠； 分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等。,转移大鼠生长素基因的小鼠,未来可能出现的人造动物？,二、基因工程在工业中的应用,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,用外源基因改造酿酒酵母，产
27、生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。,1. 纤维素的开发利用,2. 酿酒工业,三、基因工程在医药上的应用,1976年，27岁的风险投资人Robert Swanson与University of California的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。,第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,Genentech的骄人业绩,制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS）,2. 用微生物生产药物,3. 技术设
28、计高效高特异性的生物制剂,4. 研制疫苗,1. 用转基因植物或动物生产药物,大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等,应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂,美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）,中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）,6. 法医鉴定,7.基因治疗,5. 基因诊断,将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。,基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。,（仍在探索阶段）,医药,药物基因组学,人工设计,克隆P450s,疾病的动物模型,治疗性小分子,植物,微生物,诊断用蛋白,治疗性蛋白,微生物,动物,疫苗,植物,微生物,治疗性核酸,基因治疗,基因修复,反义药物,DNA疫苗,诊断性核酸,遗传病,传染病,用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。,四、基因工程在环境保护中的应用,1. 检测水污染,2. 生物降解,用重组细菌或转基因鱼等检测水污染,基因工程不是发现，而是创造。,思 考 题,什么是基因，它和细胞、染色体的关系如何？ 为什么认为1973年是基因工程诞生的元年？ 上世纪4070年代初分子生物学领域理论上和技术上的哪些重大突破对于基因工程的诞生起到了决定性的作用？ 在你的脑海中，基因工程的基本流程是怎样的？基因工程在现实生活中有何应用价值？,
