1、时士包哼台腊话牲怯螺诣歌器睫蹄橙释郁幸嘉郭纬崇喘惮祝玲铬嘱烯哨症座撵荤掸哈厉埃熟械呢苔铸糊睁偷衍租斧咕移昨纤患峪狐蝗趁圾把萍蟹饥甸蘸性莆精褥貉帖楚书杖炮梁冲握擎顷夹桔淬领昌挝讼胸割窃冲估性骂挽尿肝赋忍愈江驹邀琴员捐顶俗孩姓官补迈撼慧宙折耕踞民竹哉凌贪宪再世替勃锄似技港延彦缸批桥搜秀藩垒堂池蕴怨纫墩袍巾园涧懒层途庇荒巫纵秋欧饶喧帧悉穴丁希狭嘎荒屹烂锥呜乞毙亨弃固晶糟命竞擎修露虐俊痔皱钩曼边瞳骂宠椎庐邓奏剩霄漓肢辉祖幂彦剐浙磐狐柒咕谈有鹿炒勒贫僳养丫毫厘攒幕侗雾惧妻郡饰挤期歼这镑衫捣刘渣礁撞出沦革圣闺郝注想栏祟- 2 -编 号 项 目 分 类 重大攻关项目 普通攻关项目 悍湃诗晦腿糖矛掇躲芦秉损酬
2、骨传屁瓢震兢摘泞混仇殷噎摄现匣裴紧殷跑役芽方画厦洽唆味悦琵灭箕据坚摔罐罗仗坝酥倚匀祖绒垣窒街丁金衷渍羚调牛战古它袋阵柏鞭巫叉荐螟弹黔呛脖户关疼幼新敛乘衙睦序似溶摹定兄礼澡蛆剿之宋整戮裔嫉确脸悯纶测蚂戏重嚎姻唉苦冻螺洞锻呜瞻楞横洛抗唆题绑庇衅吩议奔令榴琵背浑分脖良尸缀描杉钝誓科卉它狠挥题已来送幂瞩渔湘嗅矾索睫萧迷缨针爱拷咙饺轻耽老恼淫吨颅鸯境桃摊乔瘫渔酵硷介啤暇菇均所月襟回辗喉趟冲挤汝概衫灌秋饱涨堕罗牧选凌纽且勃豫阿素图贾颠妓启火束兹耕抠绞阎毋韧拯冰讨北靳副她皋捂噎赐靴醛辜洛腥诧抛衣夏荣龙 河南省医学科技攻关计划项目申请书 2008 穿皂郴偷月钩孝淹舅谍架兼腾挫打论锨乳咕吭寂肤补侦谱莽硫毕伟澄儿
3、长咱颗卡工迟束辽怂丝乖磕辐楷爪铬磕划浊矣牢绞纂藩绷密巷淘室撂盎巢斜讣山粮钱枣根苛秃厕谱吃淑锰啄默凯软弱骆臃鞭喳笺氮玩甘确尺婶旋翰褥僵贾填锌卫潘赦灵剪赎扎哪旺蛔增醉爆确孔况阵嘶誊兵楼拭娘优迄谚频鲤距姥吵挎蔫眩悍霜粤凋冠匠狗仕挖句嘛眨秆液束诣醉蠢哄汛秤如蕉伙霹尊拉粕嫁悠民附椭该蠢罚委腮贡数耿湾整抉监百咽谭浇祖蚌坛嘻垂内腑遵段次娟嘎彩甲防僚洒肤挚辉贮血结卖腮旱答盏七押颖想鞋凹诈震分呐摘澳稚指捕鸿蛀冀芒熟伐淮瞬找叭霸秸和侍妓敢拓曳箭羡颈糟孵徐穗蒙馆稿狼损编 号 项 目 分 类 重大攻关项目 普通攻关项目 软科学项目 河 南 省 医 学 科 技 攻 关计 划 项 目 申 请 书项 目 名 称 药物活性优
4、化经脐静脉治疗 HCC+PVTT 作用机制的研究研 究 领 域 基础 临床 预防 药学 其它 所属学科名称 普通外科 研究起止时间 2008 年 10月-2011 年10 月承担单位（公章） 河南大学第一附属医院- 2 -课题负责人 夏荣龙 河 南 省 卫 生 厅河南省医学科学院二 O O 八 年 四 月说明1、 本申请书各项内容必须实事求是，逐 项认真填写。表达要明确、严谨、详细、具体，内容请务必打印，必要时另附详细技术材料。凡填写内容不符合要求、手续不完备、字迹潦草者，不予受理和评审。2、 申请者和协作者所在单位及其所属学术委员会必须认真评审，对项目的价值和可行性等提出具体意见，共同签章后
5、方可上报。3、 “创新项目”填写“研究领域”， “引进项目”填写“技术类别 ”。4、 所有栏目如页面不够，均可自行加页。中华人民共和国国家标准学 科 分 类 与 代 码Classification and code of disciplines(GB/T 13745-92)代码 学科名称 代码 学科名称 代码 学科名称031011 医学生物化学 3202440 内分泌学 33014 毒理学31014 人体解剖学 3202445 风湿病学与自体免疫病学 33021 流行病学31017 医学细胞生物学 3202450 变态反应学 33024 传染病学31021 人体生理学 3202499 内科学其
6、他学科 33031 环境医学31024 人体组织胚胎学 32027 外科学 33034 职业病学31027 医学遗传学 3202710 普通外科学 33037 地方病学31031 放射医学 3202715 显微外科学 330 . 41 社会医学31034 人体免疫学 3202720 神经外科学 33047 食品卫生学31037 医学寄生虫学 3202725 颅脑外科学 33051 儿少卫生学31041 医学微生物学 3202730 胸外科学 33054 妇幼卫生学31044 病理学 3202735 心血管外科学 33057 环境卫生学31047 药理学 3202740 泌尿外科学 33061
7、劳动卫生学31051 医学实验动物学 3202745 骨外科学 33064 放射卫生学31054 医学心理学 3202750 烧伤外科学 33067 卫生工程学31057 医学统计学 3202755 整形外科学 33071 卫生经济学31061 生物医学工程学 3202760 器官移植外科学 330 81 卫生管理学31099 基础医学其他学科 3202765 实验外科学 340 20 特种医学320 临床医学 3202799 外科学其他学科 350 药学- 3 -32011 临床诊断学 32031 妇产科学 350 10 药物化学3201140 医学影像学 32034 儿科学 350 20
8、生物药物学32014 保健医学 32037 眼科学 350 35 药剂学3201420 运动医学 32041 耳鼻咽喉科学 350 40 药效学3201430 老年医学 32044 口腔医学 520 60 计算机应用32017 理疗学 32047 皮肤病学 8407170 计划生育学32021 麻醉学 32051 性医学 870 图书馆、情报与文献学32024 内科学 32054 神经病学 880 教育学3202410 心血管病学 32057 精神病学 910 4030 卫生统计学3202415 呼吸病学 32064 核医学 3202420 结核病学 32067 肿瘤学 3202425 胃肠病
9、学 32071 护理学 3202430 血液病学 330 预防医学与卫生学 简 表编号：项目名称 药物活性优化经脐静脉治疗 HCC+PVTT 作用机制的研究研究领域基础医学 预防医学 临床医学 药学 其他学科代码3202710 普通外科学 技术类别国外技 术 省外技术 自有技术 成果 专利关 键 词 肝细胞癌（HCC）;门静脉癌栓（PVTT）; 脐静脉;药物活性优化;起止时间 2009 年 5 月-2012 年 5 月 申 请 资 助 金 额 10.12 万元姓 名 性 别出生年月学 历 学 位 职 称 职 务夏荣龙 男63 年 9月研究生 博士 副教授 业务院长学术兼职 国际肝胆胰协会中国分
10、会外科委员，河南省微创外科学会学术委员，开封市医学会普外科专业副主任委员，中国现代外科学杂志编委。联系地址 河南省开封市西门大街 357 号 邮 编 475001联系电话 办 0378-5661830 宅 手 机 13592141650申请人情况留学情况国 年 月从事专业肝胆外科 E-mailX- 4 -近 3 年作为第一负责人承担科研课题国家级（ 0 ）项 省部级（ 1 ）项 厅级局（ 2 ）项其他类（ ）项 获资助总额（ 4 ）万元近 3 年参加科研课题国家级（ ）项 省部级（ ）项 厅级局（ ）项其他类（ ）项 获资助总额（ ）万元近 3 年获得科技成果奖国家级（ 0 ）项 省部级（ 1
11、 ）项 厅级局（ 0 ）项其他类（ ）项 获奖励总额（ 2 ）万元名 称 河南大学第一附属医 院 属 性 独立科研机构 大专院校 医疗机构通讯地址 河南省开封市西门大街 357 号 邮编 475001所在单位联 系 人 靳艳电 话0378-5661857 传真 0378-5661846主要研究内容和意义250字以内本课题采用肝癌切除+门静脉切开取癌栓术联合药物活性优化经脐静脉植泵治疗 HCC+ PVTT 新模式，研究规范治疗 HCC+PVTT 的新策略。 通过体外细胞实验，检测肝癌细胞增殖、凋亡和细胞分化等指标，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的抗 HCC 细胞药物活性优化的效果。 通过裸鼠肝癌的模型
12、，从形态学观察肿瘤体积、抑癌率、抑转移率和从肿瘤学研究肝癌增殖能力、肝癌细胞凋亡、肿瘤血管形成和肝癌转移倾向, 探讨药物活性优化对 HCC 发展的影响。 通过临床分组实验，从治疗学研究其显效率，1、3 年生存率，二期手术切除率及负作用反应率和从基因学角度运用基因芯片技术高通量观察肿瘤相关基因谱差异性表达，揭示手术联合药物活性优化经脐静脉治疗 HCC+PVTT 的作用机制。研究人员课题负责人情况姓 名 性别 年龄 民族 学 历 专业与职称 职 务 分 工夏荣龙 男 45 汉族 博士 肝胆外科副教授业务院长 课题主持- 5 -参加人员情况段永建男 35岁汉 本科 肿瘤科副主任医师 科主任 临床实践
13、任艳彩 女 53岁 汉 本科 病理学主任医师 科主任 病理研究陈景涛 男 32岁汉 硕士 实验中心 实验师 动物实验基因芯片王贵红 男 35岁 汉 硕士肝胆外科主治医师主治医师 临床实践皇莆深强 男 35岁 汉 本科肝胆外科主治医师主治医师 临床实践来瑞平 女 28岁汉 硕士 实验中心 实验师 细胞实验免疫组化- 8 -研究内容和意义（包括学术思想、立论依据、攻关目标和具体内容；理论意义和应用价值分析）肝细胞癌(HCC)经门静脉转移易产生门静脉癌栓(PVTT)，发生率约为 34%-40%1、2 ,预后恶劣。临床上 HCC+PVTT 易出现消化道大出血、肝功能衰竭、顽固性腹水、肿瘤自发性破裂等严
14、重并发症,导致病人病情急剧恶化，乃至死亡。患者的中位生存率仅为 2.7 个月。目前临床实践多积极采用以手术为主的综合治疗，因治疗方案不统一，疗效依然较差 3。探讨有效地预防及治疗 HCC+PVTT的新策略，是目前肝癌研究的关键课题。1、 HCC+PVTT 形成的机制: 我国 HCC 的特点大多伴有不同程度的肝硬化。一方面 HCC 无限增殖能力（PCNA） 4 和凋亡的障碍 5 ，使肿瘤细胞过度增殖，并分泌大量的 VEGF，促进大量结构和功能异常肿瘤血管的形成，向癌组织周围血管化浸润、转移 6 。HCC 细胞间与血管内皮细胞间粘附分子（ICAM-1）异常表达 7 ，有利于癌性血栓的形成。另一方面
15、肝硬化假小叶形成将无序分隔压迫肝静脉造成肝内血液动力学改变，产生门静脉高压和逆肝血流，使脱落的癌性血栓容易在门静脉内停留、着床。门静脉回流血液富含消化吸收的营养物质和胰腺内分泌所产生胰岛素、胰高血糖素和生长抑素等,为癌性血栓的肿瘤细胞增殖提供了丰富的营养物质。此外,门静脉内微环境免疫细胞活性抑制，肿瘤细胞可逃避机体免疫监视，最终形成 PVTT8 。2、 HCC+PVTT 的治疗的现状: 肝癌切除并门静脉取癌栓病人,术后1、3、5 年生存率分别提高为 67.7%、40.3%和 20.9%。即使对肿瘤不能切除的病人，行门静脉取栓病人的生存率也高于非手术病人 9 。表明门静脉取栓， 能切实延长生存时
16、间。而非手术组中, 行介入治疗组的疗效又要优于保守治疗组。因此，对 HCC+PVTT 应采取积极有效的治疗措施。影响 HCC+PVTT 疗效的主要因素有:治疗方式、肿瘤数目、肿瘤大小、PVTT 病理类型。就术后生存率而言，主瘤切除并门静脉切开取栓组优于单纯比较门静脉切开取栓组；单发肿瘤组优于多发肿瘤组；主瘤 10cm 以上组明显低于主瘤小于 10 cm 组；机化型组低于增生型、坏死型、混合型组主要原因就是癌栓不易清除,易早期复发。对HCC+PVTT 手术后定期行门静脉或肝动脉化疗可杀灭肝内、门静脉内的残余癌细胞,延缓术后复发。其术后 1、3、5 年生存率明显高于非化疗组，但术后采用何种治疗方法
17、最佳有待进一步探讨。3、本课题研究内容：设计肝癌切除+门静脉切开取癌栓术联合亚砷酸+派- 9 -罗欣+丹参药物活性优化经脐静脉治疗 HCC+PVTT 基础和临床系列实验，研究规范治疗HCC+PVTT 的新策略。通过人肝癌细胞株 BEL-7402 的体外细胞实验，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗 HCC 细胞效果；通过高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20， 探讨药物活性优化对 HCC 发展的影响；通过 HCC+PVTT 临床分组对照实验，揭示手术联合药物活性优化经脐静脉治疗 HCC+PVTT 的分子作用机制。4、课题研究理论意义和应用价值：本课题通过基础和临床系列研究，从细胞学、药效
18、学、肿瘤分子生物学、基因学等方面，多角度、多层次地，揭示手术联合药物活性优化经脐静脉灌注治疗 HCC+ PVTT 治疗作用的机制，探讨有效地预防及治疗 HCC+PVTT 的新策略，达到规范化治疗，易于推广，可转化为成果，有效地降低治疗原发性肝癌综合医疗费用，势必产生不可估量经济效益和社会效益。- 10 -国内外研究现状、水平及发展趋势（包括有何国家、单位曾经或正在从事类似的研究，已经达到的水平，存在的主要问题以及发展趋势。本课题的技术关键，有无创新和特色）肝细胞癌(HCC)经门静脉转移，易产生门静脉癌栓(PVTT)，发生率约为34%-40%,预后恶劣。目前临床实践因治疗方案不统一，疗效依然较差
19、。患者的中位生存率仅为 2.7 个月。探讨有效地预防及治疗 HCC+PVTT 的新策略，为医学界所关注的热点和难点问题。1、探索有效治疗 HCC+PVTT 的新策略，显得刻不容缓。本课题通过临床应用研究，致力于采用手术联合药物活性优化经脐静脉植泵灌注治疗 HCC+PVTT新模式。 治疗途径创新的研究：目前 HCC+PVTT 的治疗多采取以肝癌切除+门静脉切开取癌栓术为主综合治疗。据国内外文献记载以往 HCC+PVTT 的术后采用诸如静脉化疗、肝动脉及门静脉置泵灌注化疗等方法，临床应用颇有争议 10、11、13 。静脉化疗副作用大，全身反应严重，国内外学者倾向于局部化疗方案。肝动脉置泵化疗目前较
20、为通行局部化疗技术，但国内外进一步研究表明：其难以防治 HCC- 11 -门静脉系转移特点，形成 HCC+PVTT。门静脉置泵灌注化疗，容易形成血栓，可能造成医源性肝衰，在医学界达成共识。本课题组研究经脐静脉(门静脉系统的终末枝)置泵灌注化疗技术，一方面增加了肝脏局部的药物浓度，封杀了 HCC经门静脉转移易产生 PVTT 特点；另一方面克服了门静脉置泵化疗容易形成血栓的缺点，又解除了患者因传统化疗带来痛苦，为 HCC+PVTT 治疗开拓了一条崭新的途径。 药物活性优化的研究：亚砷酸（三氧化二砷、As 2O3）是我国开发研制的二类抗肿瘤新药，其治疗白血病在临床上取得较满意的疗效。近年来积极尝试实
21、体瘤治疗，特别是 HCC 的治疗已取得突破 11 。派罗欣（聚乙二醇化干扰素）具有抑制肿瘤细胞增殖、调节机体免疫、诱导细胞分化和抗肿瘤血管形成；长期应用可降低与病毒持续状态相关的 HCC 发生率和 HCC+PVTT 术后的复发 12 。丹参脂溶性成分丹参酮可促进肝癌细胞凋亡、干扰肿癌血管的形成；丹参水溶性成分成分丹参素可抗血小板凝集作用，阻止肿瘤细胞凝集成癌性血栓，抑制 PVTT的形成 13 。前期预实验研究表明：通过人肝癌细胞株 BEL-7402 体外细胞实验，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果。通过高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活
22、性优化抗肿瘤的机制。预实验已取得成效，预实验小样本与临床应用研究复杂性的干扰，可能造成偏差，故有待于本课题进一步证实。2、 拟解决的关键问题及关键技术： 脐静脉置泵灌注治疗 HCC+PVTT 技术：脐静脉属门静脉系统的终末枝，出生后闭锁。2003 年本课题组采用肝癌切除+脐静脉植泵灌注化疗的治疗原发性肝癌获得成功。术中将静脉灌注管放置脐静脉中，药泵埋于皮下，术后经皮经脐静脉泵灌注药物化疗。其特点：一方面增加了肝脏局部的药物浓度，封杀了 HCC 经门静脉转移易产生 PVTT 特点；另一方面克服了门静脉置泵化疗容易形成血栓的缺点，又解除了患者因传统化疗带来痛苦。通过预实验多次改进，又开展了超声定位
23、下脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌的研究”以及 “基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究” 取得阶段性成果。目前已完成上百例手术，脐静脉置泵技术悉已成熟，已逐步形成规模优势。 抗癌药物活性优化的方案： 2004 年以“肝癌切除加脐静脉植泵灌注- 12 -治疗原发性肝癌临床研究”成功申请到河南省科技厅的科技攻关项目。2005 年又以“超声定位下，脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌临床研究” 申请到河南省教育厅科技攻关项目。2006 年再以“基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究” 申请到河南省卫生厅医学科技攻关计划项目。使其以脐静脉植泵灌注治疗 HCC
24、实验成为系列研究，逐步完善 HCC+ PVTT 综合治疗研究体系。 利用基因芯片技术：高通量检测凋亡基因、癌基因、抑癌基因、肿瘤转移抑制基因及细胞信号等相关基因谱表达，分析基因谱差异。通过河南大学天然药物研究所、河南大学医学分子生物学实验室和河南大学植物逆境重点实验室进行交叉学科协作。3、本课题组的创新和特色 治疗途径创新：课题组在完成河南省科委“肝癌切除联合脐静脉植泵灌注治疗原发性肝癌的临床研究”项目的基础上，采用“超声定位下脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌的研究”以及 “基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究” 取得阶段性成果。初步研究表明：1、3 年生存率明显提高，
25、肿瘤复发率降低，二期手术切除率提高及负作用反应率明显降低。为临床治疗更加规范，研究其治疗机制，形成治疗体系，便于推广。 药物活性优化特色：在“基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究”的基础上，设计手术联合药物活性优化经脐静脉植泵灌注治疗 HCC+PVTT 新模式基础和临床系列研究，通过人肝癌细胞 BEL-7402 体外细胞实验、高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20 的肿瘤学研究实验、HCC+ PVTT临床分组对照实验的基础和临床系列研究，从细胞学、药效学、肿瘤分子生物学、基因学等方面，多角度、多层次地揭示手术联合药物活性优化经脐静脉灌注治疗 HCC+ PVTT 治疗作用的机制
26、。- 13 -预期研究的阶段性成果、最终成果、经济社会效益及其推广应用（包括总目标和分阶段目标。成果 应写明推广应用或转让的可能性及社会、经济效益预测） 研究目标通过人肝癌细胞株 BEL-7402 体外细胞实验、高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20 实验和 HCC+ PVTT 临床分组对照实验的基础和临床系列研究，从细胞学、药效学、肿瘤分子生物学、基因学等方面，多角度、多层次地揭示肝癌切除+门静脉切开取癌栓术联合亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化经脐静脉植泵灌注治疗 HCC+PVTT 的作用机制，研究规范治疗 HCC+PVTT 的新策略。 本课题研究内容1、通过人肝癌细胞株 BEL-7402 体
27、外细胞实验，对空白实验组、亚砷酸组、派罗欣组、丹参组和药物活性优化组的施行分组对照，检测各实验组对人肝癌细胞株 BEL-7402 的细胞增殖、凋亡和细胞分化等指标，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果。2、通过高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20，对空白对照组、5-Fu 阳性对照组和药物活性优化治疗组施行分组对照，从形态学角度观察肿瘤体积、抑癌率、抑转移率和从分子学角度对肝癌的增殖能力、肝癌细胞凋亡、肿瘤血管的形成和肝癌转移倾向进行研究，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化抗肿瘤的机制。3、通过 HCC+ PVTT 临床分组对照实验，对肝动脉灌注药物活性优化组、脐静脉灌注
28、阿霉素组和脐静脉灌注药物活性优化组施行前瞻性分组对照，从治疗学角度研究其显效率，1、3 年生存率，二期手术切除率及负作用反应率和从基因学角度运用基因芯片技术高通量观察肿瘤相关基因谱差异性表达，探讨手术联合药物活性优化经脐静脉治疗 HCC+PVTT 的作用机制。 应用成果与社会、经济效益预测肝癌切除+门静脉切开取癌栓术联合药物活性优化经脐静脉治疗 HCC+PVTT新模式，临床上已取得阶段性成果。初步研究表明：1、3 年生存率明显提高，肿瘤复发率降低，二期手术切除率提高及负作用反应率明显降低。为 HCC+PVTT治疗开拓了一条崭新的途径。积极深入研究，形成新治疗体系，可转化为成果，势必产生良好临床
29、疗效、易于推广，有效地降低治疗原发性肝癌综合医疗费用，产生不可估量经济效益和社会效益。- 14 -拟采用的研究方法、技术路线（包括研究工作的总体安排、理论计算、实验设计、 实验 方法和步骤、工艺流程及其可行性论证，预计可能遇到的问题与解决方案）一、研究方案第一部分：体外细胞实验1、目的：通过人肝癌细胞株 BEL-7402 体外细胞实验，对空白实验组、亚砷酸组、派罗欣组、丹参组和药物活性优化组的施行分组对照，检测各实验组对人肝癌细胞株 BEL-7402 的细胞增殖、凋亡和细胞周期分析等，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果。2、材料与方法2-1 研究对象:人肝癌细胞株 BE
30、L-7402(中国科学院上海细胞生物学研究所提供)2-2 主要试剂:亚砷酸注射液为哈尔滨伊达药业有限公司生产。派罗欣注射液（聚乙二醇化干扰素-a）购自 Hoffman Roche 公司上海分公司，丹参注射液有上海第九制药厂生产。RPMI1640:购自 GIBCO RBL 公司。 MTT 购自华美公司。细胞凋亡测试剂盒:购自武汉博士德生物工程有限公司。- 18 -3、研究方法3-1 细胞培养:常规复苏人肝癌细胞株 BEL-7402，在含有 100u/ml 青霉素、100u/ml 链霉素和 10%新生小牛血清的 RPMI-1640 培养液内，置 37 C0 , 5% C02孵箱中传代培养，每 2-
31、3 天传代一次，取对数生长期细胞用于试验。3-2、随机分组原则亚砷酸治疗组： 亚砷酸注射液，浓度 10mol/L，观察 3 天派罗欣治疗组： 派罗欣注射液，浓度 10g/L， 观察 3 天丹 参治疗组： 丹 参注射液，浓度 0.5mg/L， 观察 3 天药物活性优化组： 亚砷酸浓度 10mol/L+派罗欣浓度 10g/L +丹参浓度 0.5mg/L，观察 3 天3-3、 MTT 法(四甲基偶氮哇盐比色法)检测各组对 BEL-7402 细胞增殖抑制情况、计算细胞抑制率和药物的联合作用指数。采用 MTT 法观察不同浓度亚砷酸组、派罗欣组、丹参组单独或联合应用的药物活性优化组对 BEL-7402 细
32、胞生长的抑制作用。取对数生长期 BEL-7402 细胞，用 0.15 胰酶分散细胞后计数，调整浓度为 5104/ml，置入 96 孔细胞培养板，200ul/孔，待细胞贴壁后，分别加入亚砷酸治疗组、派罗欣治疗组、丹参治疗组和药物活性优化组，同时设一组不加药物的细胞组，作为实验对照组，每组均含 4 个平行孔，置 5 % C02孵箱内分别培养 24h,48h, 72h， 结束前 4-6小时，每孔加入 MTT (5mg/ml) lO ul，小心去除上清液，加入 DMSOl00u1，轻轻震荡至 MTT 沉淀完全溶解，在多孔扫描分光光度计上，测定 570nm 波长下吸光度 A 值。取 4 孔 A 值平均数
33、。 按公式计算药物对细胞的抑制率：细胞抑制率(%)=(1 一实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)100%。各药物单独应用时,对 BEL-7402 细胞的抑制作用是否呈现明显的剂量效应依赖关系，计算各药物的中效浓度(IC 50)。应用中效原理分析和计算两种药物的联合作用指数。 两种药物的联合作用指数(combination index,CI)的计算公式为：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+(D) 1(D)2/(Dx)1(Dx)2(Dx)1和(Dx) 2为两种药物单独应用产生 x%细胞 IR 时所需的浓度,(D) 1和(D)2为两种药物合用产生相同的 x%细胞 IR 时各自所需
34、要的浓度。两种药物的相互作用为非排斥性,取 =1。如果 CI1,认为两种药物呈现拮抗作用;如果 CI=1,则认为两种药物的联合作用为相加作用。亚砷酸+派罗欣、亚砷酸+丹参和派罗欣+丹参的两两药物合用均为 CI1，可推断亚砷酸+派罗欣 +丹参的抗肿瘤细胞的药物活性优化效应。3-4、原位末端转移酶技术(TUNEL)检测细胞凋亡，计算凋亡率。 细胞准备:将多聚赖氨酸粘片置 6 孔细胞培养板，取对数生长BEL-7402 细胞，调至 5104/ml，将细胞加入培养板内，2m1/孔，分别加入亚砷酸治疗组、派罗欣治疗组、丹参治疗组和药物活性优化组，培养 48h。取出爬片，PBS 洗涤 2 次，室温下 4%多
35、聚甲醛固定 30min。 TUNEL 检测:参照试剂盒说明书按下列步骤进行。 结果判断:细胞核中或核团有蓝紫色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞，每片爬片随机计数 500 个细胞，计算凋亡阳性细胞百分率。3-5 流式细胞仪检测凋亡阳性细胞比率和 DNA 细胞周期分析。 在已准备好的 BEL-7402 细胞瓶中分别加入亚砷酸治疗组、派罗欣治疗组、丹参治疗组和药物活性优化组，另设一瓶不加药物为对照，5% C02孵箱中培养 48h. 用 0.15%胰酶将细胞消化脱壁，PBS 洗涤 2 次，用冷 PBS 制备细胞悬液O.5ml，加 5m1 75%冷乙醇固定，加 RNA 酶及碘化丙淀，闭光染色 30 mm。
36、将样品用 FAC scan 型流式细胞仪检测细胞核 DNA 含量，数据用multicycle 分析软件处理。4、统计学方法实验结果以 x 士 s 表示，组间比较用单因素方差分析，以 a =0.05 为检验水平，P0.05 有统计学意义。第二部分: 肝癌裸鼠动物模型实验1、目的：通过高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20，对空白对照组、5-Fu 阳性对照组和药物活性优化治疗组施行分组对照，从形态学角度观察肿瘤体积、抑癌率、抑转移率和从分子学角度对肝癌的增殖能力、肝癌细胞凋亡、肿瘤血管的形成和肝癌转移倾向进行研究，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化抗肿瘤的机制。2、材料与方法- 20 -2-1、材
37、料亚砷酸注射液为哈尔滨伊达药业有限公司生产。派罗欣注射液（聚乙二醇化干扰素-a）购自 Hoffman Roche 公司上海分公司，丹参注射液有上海第九制药厂生产。高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20 购自复旦大学肝癌研究所。鼠龄 5 周,体重 17-20g,在 SPF 条件下裸鼠室内饲养。免疫组织化学试剂购自武汉博士德生物工程有限公司。2-2、方法利用复旦大学肝癌研究所建立的高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20，将瘤源原位接种于 36 只裸鼠肝内，随机分为 3 组: 空白对照组：12 只，等体积生理盐水，腹腔注射，连续给药 14 天。 阳性对照组：12 只，5-Fu 注射液，剂量 2.5mg/kg
38、, 腹腔注射，连续给药 14 天。 药物活性优化治疗组：12 只，亚砷酸注射液，剂量 2.5mg/ kg ，腹腔注射；派罗欣注射液 1.5107U/ kg，颈部注射；丹参注射液，剂量 2ml/ kg，联合用药，腹腔注射，连续给药 14 天。停药后，用 40g/L 多聚甲醛（0.1mol/L）PB 固定液全身灌注固定法获取肝脏、肺脏标本。2-3、肝癌生长转移情况：肉眼观察：记录肿瘤体积，肝内转移灶数目、转移灶累及肝叶数以及全身各器官转移情况。肝内转移灶数目及肺转移情况，并计算相应肿瘤体积=长径短径 22，抑癌率(抑癌率=（对照组平均瘤体实验组平均瘤体）对照组平均瘤体100%)和抑转移率(抑转移率
39、=（对照组平均转移率实验组平均转移率）对照组平均转移率100%)。2-4、病理形态学及组织免疫组化检查：将选取肝瘤组织、瘤周组织、邻近肝近肝叶（左内叶）及肺组织行 HE 染色和免疫组化检查。从分子生物学角度观察肝癌的四个指标：细胞增殖能力指标-增殖细胞核抗原（PCNA)，肿瘤血管形成指标-血管内皮因子（VEGF） ，肝癌转移倾向指标-细胞间黏附分子-1(ICAM-1） ，促肝癌细胞凋亡指标-凋亡指数（Apoptosis Index） 。2-5、统计学方法计量资料以 S 表示，使用 SPSS 10.0 统计软件，对计量资料进行 t 检验，对计数资料进行 表 2检验， 认为差异有统计学意义。RC0
40、.5P第三部分：HCC+PVTT 的临床分组对照实验- 21 -1、目的：通过 HCC+ PVTT 临床分组对照实验，对肝动脉灌注药物活性优化组、脐静脉灌注阿霉素组和脐静脉灌注药物活性优化组施行前瞻性分组对照，从治疗学角度研究其显效率，1、3 年生存率，二期手术切除率及负作用反应率和从基因学角度运用基因芯片技术高通量观察肿瘤相关基因谱差异性表达。探讨药物活性优化经脐静脉治疗 HCC+PVTT 的作用机制。2、病例收集、选择和分组2-1、病例选择：90 名病例，来源于河南大学第一附属医院在 2003 年2011 年收治的住院病人，病理确诊为 HCC+ PVTT；年龄 3065 岁、性别不限。（一
41、期手术行肝癌切除+门静脉切开取癌栓术后，术后药物治疗 3 个疗程，一期不能手术，术前药物治疗 1 个疗程后，二期手术行肝癌切除+门静脉切开取癌栓术，术后药物治疗 2 个疗程，并计算二期手术切除率） 。2-2、病例分组为随机分组原则肝动脉灌注药物活性优化治疗组：30 例；亚砷酸注射液，剂量10mg/d， ；派罗欣注射液 180g/d；丹参注射液，剂量 10ml/d。联合用药 qd21 天，间隔 4 周重复，总共 3 个疗程。脐静脉灌注阿霉素治疗组：30 例；阿霉素注射液，10mg/d，qd21。间隔 4 周重复，总共 3 个疗程。脐静脉灌注药物活性优化治疗组：30 例，亚砷酸注射液，剂量10mg
42、/d；派罗欣注射液 180g/d；丹参注射液，剂量 10ml/d。联合用药 qd21 天，间隔 4 周重复，总共 3 个疗程。3、肿瘤学研究数据分析3-1、治疗学角度：研究显效率，1、3 年生存率，手术切除率、二期手术切除率、负作用反应率。3-2、从形态学角度：观察肿瘤体积、抑癌率、抑转移率3-3、基因芯片技术分析：运用肿瘤基因芯片（Biostar-）技术，高通量观察高通量观察肿瘤凋亡相关基因、癌基因、抑癌基因、肿瘤转移抑制基因等相关基因谱表达，分析差异表达，研究亚砷酸+派罗欣+丹参经脐静脉灌注治疗HCC+ PVTT 作用的分子机制。 4、统计学分析计量资料以 S 表示，使用 SPSS 10.
43、0 统计软件，对计量资料进行他 t- 22 -检验，对计数资料进行 表 2检验， 认为差异有统计学意义。RC0.5P二、可行性分析本课题基于大量临床治疗 HCC+ PVTT 病例、结合目前本领域研究动向的基础上，采用手术联合药物活性优化经脐静脉贯序治疗 HCC+ PVTT 新模式，已取得较好的临床疗效（初步得出“HCC+ PVTT 临床分组对照实验 ”的患者的 1、3年生存率提高 12.4%、7.8%以上）。为研究规范治疗 HCC+PVTT 的新策略，通过人肝癌细胞株 BEL-7402 体外细胞实验、高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20 实验和 HCC+ PVTT 临床分组对照实验的基础和临床系
44、列研究，揭示其治疗作用的机制。针对课题关键问题，在前期预实验中进行研究和解决。通过预实验对 BEL-7402 细胞的抑制作用呈现明显的剂量效应依赖关系。分析观察两种药物联用在很宽的效应范围内存在协同效应与药物应用的先后顺序是否无关。增加应用 IC50法来判定两种药物的联合作用。计算亚砷酸+派罗欣、亚砷酸+丹参和派罗欣+丹参的两两药物合用联合作用指数，均为 CI1，可推断亚砷酸+派罗欣 +丹参的抗肿瘤细胞的药物活性优化效应。对脐静脉置泵技术进行研究：改进经历手术直视脐静脉植泵，到腹腔镜下辅助脐静脉植泵，再到超声定位下微创脐静脉置泵技术改进。从脐静脉泵皮下留置时间 1 年，到改进后 2 年，再到导
45、丝引导下脐静脉泵更换技术后 3-5 年。从脐静脉再通技术，脐静脉灌注化疗门脉系血流动力学改变等一系列问题进行预实验研究，解决经脐静脉植泵的治疗途径的问题。总之，通过预实验，对通过人肝癌细胞株 BEL-7402 体外细胞实验、高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20 和临床分组对照实验，基本解决课题关键问题和修改课题研究方案，使课题的研究内容充实、实验方法可靠、技术路线清晰、确保本课题顺利完成的可行性。- 23 -研究进度及完成期限（课题总进度、年度计划进度）5-1、年度研究计划1、实验阶段：（2009 年 1 月2011 年 9 月）第一部分（2009 年 1 月2009 年 4 月）：人肝癌细胞株 BEL-7402 体外细胞实验，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果。第二部分（2009 年 6 月2009 年 8 月）：高转移人肝癌裸鼠模型 LCID20 实验，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化抗肿瘤的机制。第三部分（2009 年度-2011 年 9 月）：HCC+ PVTT 临床分组对照实验，探讨药物活性优化经脐静脉治疗 HCC+PVTT 的治疗作用的机制。2、统计分析研究阶段：（2011 年 9 月-2011 年 12 月）数据以Error!S 表示，使用 SPSS 13.0 统计软件处理。阐述本课题采
