1、Real-time PCRXiao Jin Applied SpecialistMolecular & Cellular BiologyReal-time PCR 原理数学原理化学原理Real-time PCR 应用绝对定量相对定量等位基因分型阴阳性判定microRNA荧光定量PCR数学原理基线 阈值 Ct值 DNA0同时扩增96的相同样品的结果由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异扩增曲线：四个阶段线性图谱对数图谱平台期线性增长期基线期指数增长期平台期线性增长期基线期指数增长期什么是基线？基线就是扩增曲线中的水平部分。对数图谱线性图谱基线 阈值 Ct值 DNA01. 基
2、线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。2. 偶然误差的结果满足对数分布。3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于105。5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR 的扩增使得荧光强度得以测量。什么是阈值？基线 阈值 Ct值 DNA0基线 阈值 Ct值 DNA0什么是CT值？从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数CT值对数图谱CT值线性图谱lg DNA循环数线性期y = x(1+e)n指数期为什么CT值 DNA0 ？N = N0x (1+e)nN：产物分子数； N0：起始分子数e： 扩增效率； n: 循环次
3、数PCR理论方程只在指数期成立为什么CT值 DNA0 ？第 n次 PCR循环时的荧光信号强度 (Rn)等于背景信号强度 (RB)加上每个分子的荧光强度 (即单位荧光强度， RS)与分子数目的乘积。Rn= RB+ X0(1+ e)n RsRCT= RB+ X0(1+ e)CT Rslg (RCT -RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg RsCT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT -RB) lgRs设n=CT，则：)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXC+=即CT = - k lg X0+ b （线性方程）标准曲
4、线：CT值对DNA0作图CT值lg 起始 DNACT = - k lgX0+ b成功的定量PCR荧光定量PCR化学原理SYBR Green I作用机理1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2. 染料一结合，就产生荧光信号3. 信号强度与 DNA分子总数目成正比数量关系TaqMan探针的FRETTaqManProbeEER QEERQTaqMan作用机理1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号3. 信号强度与 结合探针的DNA分子数成正比数量关系5TaqMan探针上游引物335下游引物RQ3535QRReal-time PCR 应用 绝对定
5、量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量(Relative Quantification ， RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 等位基因分型(Allelic Discrimination，AD) 基因突变分析SNP研究 物种鉴定、菌株鉴定 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC ，+/-)实时PCR分析实时 分析绝对定量绝对定量相对定量相对定量根据标准曲线提供数量测量提供精确的起始材料相对数量差异绝对定量与相对定量的定义 绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的 绝对量值，即通常
6、所说的拷贝数。 相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的 相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一个时程研究中处于零时的样本。Log copy numberCt valuesCts01234567The well contains 400 target copiesY= mx+b绝对定量：从荧光到拷贝数相对定量：参照因子 Calibratort =0t=12 t=24 t=48timetotal RNAcDNAtotal RNAcDNAtotal RNAcDNAtotal RNAcDNA用以比较结果的基准相对定量：内对照 Endogenous Contr
7、olt =0t=12 t=24 t=48timetotal RNAcDNAtotal RNAcDNAtotal RNAcDNAtotal RNAcDNA用以标准化样品操作IL-2 18S CtCt2-CtT=0 (calibrator) 24 9 15 0 1.0T=1hr 24 10 14 -1 2.0T=6hr 23 11 12 -3 8.0T=24hr 28 10 18 3 0.10246810Relative Quantityof Expression2.08.01t = 0t = 1 ht = 6 ht = 24 h0.1相对定量研究软件 同时分析多达 10块反应板的基因表达数据 多至960 个数据点的单击分析 数据直观 通过 CT(比较 Ct)法完全自动分析数据 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出终点检测终点检测阴性阳性鉴定阴性阳性鉴定等位基因分型等位基因分型目标序列的有无突变的存在形式等位基因分型 定义：等位基因分型 (AD)分析是一种 多重 （每个反应包括一个以上的引物和探针对）、终点 （在 PCR过程的终点收集数据）分析实验，用于检测某个核酸序列的 变异 。 每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核苷酸多态性（ SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。 目标序列的实际量不确定。
