1、 史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：http:/ Laser Microdissection Method to Study the Mechanism of Short-term Liver Preneoplastic Lesions in RatsRen jin*, Qi xinming, Liu linlin, Wu xiongfei(Center for Drug Safety Evaluation and Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences)ABSTRACT
2、 OBJECTIVE: To study the mechanism of liver preneoplastic lesions and the protective effects of resveratrol in short-term liver preneoplastic lesions model in rats with laser microdissection method. METHODS: Male SD rats were treated with diethylnitrosoamine (DEN) and 2-acetylaminofluorene (2-AAF) t
3、o induce liver preneoplastic lesions. The placental-type glutathione S-transferase (GST-P) positive altered hepatic foci (AHF) were evaluated as the preneoplastic marker. Oxidative stress, connexin 32 and CYP450 (especially CYP2E1) were also assessed by laser microdissection, immunohistochemical and
4、 western blot analysis. RESULTS: 1. The number and area of AHF remarkably increased in the model group (DEN + 2-AAF) and the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) also strongly expressed. Taken together, we can say that this model had been effectively built. 2. Reduced glutathione (GSH) was mark
5、edly reduced in model group, which indicated the presence of oxidative stress. 3. We used laser confocal microscope to find that the expression of connexin 32 significantly decreased in hepatocytes around central veins. 4. The enzyme activity and protein expression of CYP1A1 and CYP2E1 were up-regul
6、ated, while the expression of CYP1A2 was down-regulated. We used the laser microdissection instrument to collect the AHF. The expression of GST-P and CYP2E1 was much higher in AHF than the hepatocytes around the AHF. A specific inhibitor of CYP2E1, diallylsulfide (DAS), reduced the expression of CYP
7、2E1, meanwhile, the number and area of AHF also decreased. 5. Resveratrol had a similar effect with DAS, which also reduced the expression of GST-P and CYP2E1 in AHF and the hepatocytes around the AHF. The number and area of AHF were also decreased. CONCLUSION: In general, oxidative stress, Cx32 may
8、 be involved in the process of preneoplastic lesions. And CYP450 particularly CYP2E1 has a major role in the preneoplastic lesions. Resveratrol has a significant protection on the preneoplastic lesions, which may attribute to CYP2E1.Key words: Short-term Liver Preneoplastic Lesions in Rats, Laser mi
9、crodissection, CYP2E1, Resveratrol应用激光显微切割技术研究大鼠短期致肝脏癌前病变机理任进* 戚新明 刘琳琳 邬雄飞（药物安全评价研究中心，上海药物研究所，中国科学院，201203）摘要: 目的 建立大鼠短期致肝脏癌前病变模型，采用激光显微切割技术，探讨癌前病变机理和中药白藜芦醇可能的肝细胞保护作用。方法 以大鼠肝脏为靶器官，用已知的致肝癌化合物二乙基亚硝胺（DEN）为诱变剂，以胎盘型谷胱甘肽巯基转移酶（GST-P）标记的转化灶作为肝细胞癌前病变的终点标记，建立短期致肝脏癌前病变模型。同时检测氧化损伤、细胞间隙连接蛋白（Cx32） 、CYP450 酶等在肝脏细胞
10、癌前病变中的作用。进一步应用激光显微切割技术检测 CYP2E1 在肝脏细胞癌前病变中的作用。结果 1. 大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立 模型组 GST-P 阳性转化灶数量增多、面积增大，细胞增生指标PCNA 阳性细胞数量显著增加，表明模型建立成功。2. 氧化损伤检测 模型组肝脏组织的还原型谷胱甘肽（GSH）明显消耗。3. 细胞间隙连接蛋白（Cx32）的改变 激光共聚焦显微镜观察可见，模型组 Cx32 蛋白在中央静脉周围肝细胞的阳性染色在面积与数量上都有明显降低。 4. CYP450 酶在癌前病变中的作用 模型组 CYP2E1 和 CYP1A1 的活性增加，CYP1A1 和 CYP2E1 蛋白表
11、达均上调；CYP1A2 则表达下调。进一步用激光显微切割技术，结合连续切片的免疫组化方法，结果表明：转化灶内肝细胞 GST-P 与 CYP2E1 的蛋白表达明显高于灶外正常肝细胞。而 CYP2E1 特异性抑制剂大蒜素（DAS）抑制 CYP2E1 的表达，同时减少 GST-P 转化灶的数量和面积。5. 白藜芦醇的肝细胞保护作用 白藜芦醇与 DAS 作用相似，可以显著的降低灶内、外肝细胞 GST-P, CYP2E1 的表达，并使转化灶的面积与数目显著减少。结论 综上所述，大鼠短期致肝脏癌前病变模型中，氧化损伤、细胞间连接蛋白可能参与了早期损伤过程；肝脏细胞早期损伤可能与 CYP450 代谢酶尤其是
12、 CYP2E1 的改变密切相关。白藜芦醇有明显的肝细胞保护作用，CYP2E1 可能在其中起重要作用。关键词：大鼠短期肝脏癌前病变模型 激光显微切割 CYP2E1 白藜芦醇目前国际上常用的检测药物致癌性的实验方法主要是大鼠两年长期致癌实验。该实验的结果可靠，但费时费人工。而体外试验的假阳性和假阴性率较高，难以准确预测药物的致癌性 1。因此建立并应用快速、可靠的试验替代模型，结合两年长期致癌试验，是国际上公认的检测化学物质致癌性的有效途径。短期大鼠致肝癌模型是日本学者伊藤等于 1989 年建立的，用于检测化合物的致肝癌性。该模型自建立以来检测了三百多种化合物，其中，在肝脏致癌物的检测中，有 97%
13、的致突变物和 88%的非致突变物呈现阳性结果，非肝脏致癌物中，该模型检测的阳性率为 21。说明该模型是比较特异的检测肝脏致癌物的试验模型 12。应用这一模型也可用于早期致癌机理的研究 23，而应用先进的激光显微切割技术，将病变细胞和正常细胞分别切割下来，比较分析 RNA、蛋白等的表达差异，可提供最直接的基因、蛋白水平的变化依据，目前广泛认为，这一新技术是将形态学和分子生物学最好的结合方法。但多受昂贵的仪器设备和高难度技术的限制，因而开展的不多。众所周知，绝大多数药物和致癌物通过肝脏进行生物转化，特别是经 CYP酶系代谢后可能活化形成毒性较强的产物，对肝脏产生损害。另外，CYP 酶代谢后的产物参
14、与基因表达的调控，也参与外源或内源性致癌物前体的生物激活。有报道 CYP 基因族（即 CYP1,CYP2,CYP3，CYP4） ，承担大量的肝脏内外源性物质的代谢作用，与化学致癌物关系比较密切 4 5，但是目前关于 CYP450 参与肝脏癌前病变的研究并不多，研究较多的是 CYP2E1 在肝脏癌变过程中起到重要的作用 6。在前人研究的基础上，我们采用激光显微切割和连续切片的免疫组化技术研究了 CYP450 酶尤其是 CYP2E1 在肝脏癌前病变中的作用。白藜芦醇(Resveratrol, Rev) 化学名称为 3, 5, 4 三羟基苯二烯，是一种广泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物性食物或药物中的
15、多酚类活性单体。近年来大量的体内、体外抗癌试验结果表明，Rev 对多种肿瘤，如肝癌、乳腺癌、皮肤癌、结肠癌等均具有潜在的保护作用。大蒜素（Diallylsulfide, DAS）是多种烯丙基有机硫化物复合物，已证明它是 CYP2E1 的抑制剂 7。有文献报道 DAS 可以明显的改善 DEN 引起的肝细胞癌前病变 8，在实验中作为阳性对照。本试验首次应用激光显微切割技术，结合连续切片的免疫组化和 Western Blotting 两种分析方法，观察大鼠短期致肝脏癌前病变模型中，肝脏转化灶内肝细胞和灶外肝细胞 GST-P 和 CYP450 蛋白水平的差异，进一步分析和比较了给予 Rev 后肝细胞转
16、化灶内、外 GST-P 和 CYP2E1 蛋白表达不同，表明 Rev 具有明显的肝细胞保护作用, 而 CYP2E1 可能在其中起到重要作用。1 材料与试剂1.1 实验动物：实验用 60 只 SD 大鼠购买于西普尔必凯实验动物有限公司，饲养在中国科学院上海药物研究所的 SFP 级动物房。1.2 主要试剂：二乙基亚硝胺（DEN） 、2-乙酰氨基芴（2-AAF） 、大蒜素（DAS ） ，p-nitrophenol , ethoxyresorufin, erythromycin 购于 Sigma。白藜芦醇购买于陕西慧科植物发展有限公司，兔抗 GST-P 抗体购于 MBL 公司，兔抗CYP2E1、CYP
17、2B1/2、CYP1A1、CYP1A2 抗体购买于 Chemicon 公司，鼠抗PCNA、Connexin 32 单抗购于 Santa Cruz 公司，免疫组化 ABC 试剂盒购买于中衫金桥公司，HRP 标记的 GAPDH 抗体购买于 Santa Cruz 公司，ECL 试剂盒购买于 Amersham 公司，谷胱甘肽含量测试盒购自南京建成生物工程公司，其他试剂均为上海国药集团生产的分析纯试剂。2 实验方法2.1 大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立以大鼠肝组织为靶器官，用已知的致肝癌化合物二乙基亚硝胺（Diethylnitrosoamine, DEN）为诱变剂，以 2-乙酰氨基芴为促进剂，进行肝脏的
18、大部分切除术，促进肝细胞再生。并以胎盘型谷胱甘肽巯基转移酶（GST-P）阳性结节或病灶为癌前病变的终点标记，用形态学和免疫组织化学的方法检测 GST-P 和细胞核增生抗原（PCNA ）在肝脏转化灶中的分布和阳性率，并进行统计学的分析和比较，判断模型的建立（图 1） 。图 1 大鼠短期肝脏癌前病变模型5 周龄大鼠在动物房适应性饲养一周后，给予 200mg/kg DEN 腹腔注射，在两周时在饲料中混入 0.01% 2-AAF，三周时进行肝脏大部切除，八周时将大鼠麻醉处死取材。 A 空白对照组，B 给予 DEN，不给予 2-AAF，C 不给予 DEN，仅给予 2-AAF，D 模型组，DEN 与 2-
19、AAF 均给予，E 在模型 D 组的基础上，给予 0.1g/kg 的 Rev 灌胃，F 在模型 D组的基础上，给予 0.05ml/2d 的 DAS 灌胃给予。2.2 肝脏组织 P450 酶及亚型活性的检测我们使用差速离心法分离肝脏微粒体 9，分别检测了与致癌密切相关的CYP1A, CYP2E1, CYP2B, CYP3A 代谢酶活性： CYP2E1，CYP1A1，CYP3A1等，使用的活性检测底物分别为 p-nitrophenol , ethoxyresorufin, erythromycin10。同时使用 Western Blotting 检测 GST-P, CYP1A1, CYP1A2,
20、CYP2E1, CYP2B1/2等的蛋白表达。2.3 肝脏组织氧化损伤检测切取 100mg 肝脏组织，加入 10mL 20mM EDTA，高速匀浆。取 100 l 匀浆液，加入等体积反应溶液（10% 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）/20 mM EDTA-Na2） ，充分混匀后 3000g，4 oC 离心 5 分钟，取适量上清，加入等体积含 0.4 mM Tris-HCl，10 mM 5,5-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)，20 mM EDTA-Na2 的溶液，在 5 分钟内读取 A412 吸收值 11。以还原型 GS
21、H 做标准曲线，方法同上。2.4 Connexin 32 免疫荧光染色我们使用 Connexin 32 (Cx32)抗体与 Rhodamine 标记的二抗进行免疫荧光染色，用甘油封片后，使用 Leica TCS2 激光共聚焦显微镜观察，激发波长480nm，发射波长 540nm。2.5 免疫组化方法大鼠肝脏石蜡切片，厚度为 5um。常规脱蜡、脱水，浸入 3%H2O2 10 分钟，用 10%正常山羊血清 37封闭 1 小时，按照 ABC 法进行免疫组化染色。染色后的切片用 Leica QW550 图像分析系统进行着色面积的测定和比较分析。2.6 激光切割技术和方法肝脏组织经 OTC 包埋、-80冰
22、箱速冻后，用 Leica CM3500 冰冻切片机制成厚度 16um 的切片，平铺于附有 PET 膜的不锈钢框架上，快速 H.E 染色，显微镜下选择明确的转化灶，使用 Leica ASLMD 型 激光切割仪，将所需肝脏细胞切下，置入不同的 50ul 离心管，-80保存。按照常规方法提取 RNA 或蛋白，进行 Real-time PCR 或 Western blotting 检测（图 2） 。图 2 激光显微切割 (HE 20)(A) 快速HE 染色切割前的肝脏组织；(B) 红色标记的区域为：疑似转化灶(C) 激光切割 (D) 收集于离心管中的切割组织片。2.7 数据管理及统计分析各检查指标数据
23、录入 SPSS 进行统计学分析。结果用 meanSD 表示。两组间的比较用 t 检验或 t 检验。计量指标，用单因素方差分析（one way ANOVA）过程进行分析，采用最小显著级差法（ LSD）进行各组间比较。计数资料用卡方检验进行比较。显著性标准为 p 0.05。3. 实验结果3.1 大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立免疫组化和图像定量分析显示，D 组可见多量、大的 GST-P 染色阳性灶，面积与 A 组相比明显增加（p0.01） ，PCNA 阳性细胞数量明显增加（p0.01） 。实验结果说明短期大鼠肝脏癌前病变模型已经成功建立（图 3）(表 1)。IIIIII图 3 短期大鼠肝脏癌前损伤模
24、型I GST-P 免疫组化染色 A 空白对照组，D 模型组（DEN+2-AAF） （5）II PCNA 免疫组化染色 A 空白对照组，D 模型组（DEN+2-AAF） （10）III GST-P 免疫荧光染色 绿色荧光：GST-P，蓝色荧光：DAPI （细胞核染色）表 1. GSTP 和 PCNA 免疫组化染色的定量图象分析注： a p0.01 vs. A 组; bp0.01 vs. B 组; cp0.05 vs. B 组; 3.2 肝脏组织谷胱甘肽含量检测表 2 显示，模型 D 组肝脏组织可见明显的谷胱甘肽消耗，说明在给予 DEN和 2-AAF 后，肝脏细胞可能出现了氧化损伤。 表 2 肝组
25、织谷胱甘肽的含量GroupGSH(mg/g protein)A 65.825.02B 53.252.33bC 55.122.21bD 46.032.90aa p0.01compared to group A; bp0.05 compared to group A;3.3 细胞间隙连接蛋白（Cx32）的改变图 4 显示，与对照 A 组相比，模型 D 组中央静脉周围肝细胞 Cx32 蛋白阳性染色在面积与数量上都有所降低，但在汇管区附近肝细胞的 Cx32 阳性染色与对照组没有明显的改变。GroupGST-P foci area (mm2/cm2)PCNA (+)nuclei(1000 cells)A
26、 Not detectable 31.83 12.89B 1.16 67.67 45.13C 1.08 115.58 27.71a,cD 17.13a 134.83 30.1a,b图 4 Cx32 免疫荧光染色A.B.：对照组 A 组; C.D: 模型组 D 组。其中 A，C 为中央静脉附近;B，D 为汇管区附近。红色荧光为 Cx32 着色，蓝色为 DAPI，细胞核着色。3.4 CYP450 代谢酶在肝脏癌前病变过程中的变化3.4.1 肝脏微粒体代谢酶的表达与活性测定我们使用差速离心法分离得到肝脏微粒体后，检测各相关 CYP450 酶的表达情况与活性。图 5 显示，CYP1A1 蛋白在正常组织
27、中几乎不表达，而在损伤过程中表达上调。CYP1A2 蛋白在正常组织中大量存在，而在损伤过程中表达下调。CYP2E1 蛋白在正常组织中有稳定的表达，在癌前病变过程中也有上调。CYP2B1 的表达在癌前病变过程中下调。这些结果与前人在相似的致癌模型中报道的结果一致。图 5 CYP450 酶在各组肝脏微粒体中的表达情况每个样品是 5 只大鼠微粒体蛋白的混合，每孔上样量为 40g 蛋白。表 3 显示，D 组和 C 组的 CYP2E1 活性相比于 B 组和 A 组增加。D、B、 C 组的 CYP1A1 的活性相比 A 组都有所增加。CYP3A 的活性在A、B、 C、D 四组中没有明显的差异。表 3 CY
28、P2E1, CYP1A 与 CYP3A 的活性测定Note： a p 0.05, b p 0.01 compared to control group; c p 0.05, d p 0.01 compared to group C; e p 0.05, f p 0.01 compared to group B.3.4.2 GST-P 与 CYP2E1 在肝细胞转化灶内外的表达差别使用激光切割技术将转化灶内肝细胞和转化灶周围正常的肝细胞切下，用Western Blotting 的方法进一步检测了转化灶内、外肝细胞 GST-P 与 CYP2E1 的表达情况。图 6A 显示，模型 D 组灶内（D）G
29、ST-P 表达明显高于灶外（D） ，同时发现在给予 CYP2E1 的特异性抑制剂 DAS 后，灶内（F）和灶外（F ）GST-P 的表达均明显低于模型 D 组。同样的，模型 D 组灶内（D）CYP2E1 的表达也明显高于灶外（D） ，而在给予 DAS 后，灶内外 CYP2E1 的表达均有了显著的下降。为了进一步验证 CYP2E1 在转化灶形成过程中的作用，我们采用了连续切片的方法，检测同一个转化灶内 GST-P 与 CYP2E1 的表达情况。实验结果显示，在模型 D 组和 F 组中，GST-P 与 CYP2E1 在转化灶内肝细胞的表达呈现协同增加的趋势，两者表达的位置一致，均位于转化灶肝细胞区
30、域内（图 6B 4/5/6，10/11/12） ，而 F 组 GST-P 转化灶内肝细胞的数量和面积均明显少于模型D 组，CYP2E1 表达也相似。GroupPNPH activity (nmol/mg/min)Ethoxyresorufin O-dealkylase activity (pmol/mg/min)Erythromycin N-demethylase activity (103 pmol/mg/min)A 2.1150.258 23667.104616.95 1.460.154B 2.2160.260 126771.3218071.63b 1.420.296C 2.750.272
31、a,e 174533.8754160.03b 1.540.164D 2.8750.610b,c 61335.9210334.76b 1.560.349图 6 GST-P 与 CYP2E1 在转化灶内外的表达情况。A 每组 6 个独立样本，每个样本切割 2000 个细胞，混合处理后进行 western blotting 实验，GAPDH 作为内参。 D 灶内，D 灶外；E 灶内，E 灶外； F 灶内，F 灶外；A 对照组；B 肝脏组织连续切片后进行免疫组化实验。Group E 白藜芦醇组，Group F：DAS 组。AB 3.5 白藜芦醇对肝脏癌前病变的作用应用大鼠短期肝脏癌前病变模型研究和寻找
32、一些可能具有肝细胞保护作用的药物，以期寻找具有潜在抗肿瘤作用的药物。实验结果表明，中药白藜芦醇（E 组）可以明显的降低转化灶内肝细胞 GST-P 的表达，在灶内（ E）和灶外（E）均有明显的作用（图 6A） 。同时发现白藜芦醇和 CYP2E1 特异性抑制剂DAS 的作用极为相似，除了降低 GST-P 的表达外，同时还显著降低了灶内、外肝细胞 CYP2E1 的表达，提示白藜芦醇的肝细胞保护作用可能与其降低CYP2E1 表达的作用有关（图 6A） 。连续切片免疫组化的实验结果更进一步的验证了上述结果（图 6B 7/8/9） 。4. 讨论大鼠短期肝脏癌前损伤模型作为替代实验之一，与大鼠两年长期致癌实
33、验，已被纳入 ICH 致癌试验的指导原则中。在本实验中，应用形态学和免疫组织化学的方法证明了短期大鼠肝脏癌前损伤模型的成功建立。细胞间隙连接蛋白是机体固有的、与细胞生长发育及增殖分化等密切相关的膜表面分子，是维持机体组织器官正常结构及功能的基础。因此，它的异常与某些先天性发育畸形或功能障碍性疾病以及癌症等的发生发展密切相关。Cx32 是与肝细胞密切相关的基因，对正常肝细胞的功能维持起作用。在肝癌组织和肝癌细胞中 Cx32 的表达会有明显减少 1213，在癌前病变的组织中 Cx32 蛋白降低是转化灶细胞选择性增殖的机制之一。在我们的实验中，发现在 DEN和 2-AAF 引起肝细胞癌前病变的过程中
34、就有明显的 Cx32 表达下降，说明 Cx32可能在肝癌形成过程的早期就起到一定的作用。本试验结果表明：表达下调的 CYP450 酶有 CYP1A2 和CYP2B1/2，CYP1A2 的降低表达是肝脏损伤的一个标志，在很多肿瘤细胞中CYP1A2 表达降低 1415。实验中表达上调的 CYP450 酶有 CYP1A1 和CYP2E1，CYP1A1 是代谢 2-AAF 的主要的酶 16，它的上调表达促进了 2-AAF向致癌性代谢产物转化，因此对于肝脏癌前病变的过程起着促进作用。有文献报道 CYP2E1 的表达与肝脏癌变的过程相关 1718。 CYP2E1 的表达增加会引起细胞内 ROS 增多而导致
35、氧化损伤 1819。在实验中我们发现肝细胞中还原型GSH 含量明显下降，说明癌前病变的过程中发生了氧化损伤，而细胞内长期高于正常水平的 ROS 量会引起 DNA 损伤，细胞周期阻滞等，进而增加了细胞癌变的几率 1819。实验中我们使用了 CYP2E1 的特异性抑制剂 DAS，发现 DAS具有显著的抑制肝细胞癌前病变的能力。我们使用激光切割技术和连续切片免疫组化技术更进一步确切证明了 CYP2E1 在肝脏癌前病变的过程中具有重要作用，其作用机制可能与其引起的 ROS 增加而导致的氧化损伤有关，还需要更深入的研究其机制。中药成分白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，具有预防癌症的作用。哈佛医学院和美国老年
36、研究所的研究人员最近发现白藜芦醇对高脂肪饮食引起的小鼠肝病和心脏病均有明显的保护作用。白藜芦醇可以明显降低 GST-P 转化灶的数量和面积，降低 GST-P 和 CYP2E1 的蛋白表达，具有明显的肝脏癌前病变保护作用。白藜芦醇作用的机制可能与其抗氧化和降低 CYP2E1 表达的能力有关，具体的机制还有待深入研究。本试验成功建立了大鼠短期肝脏癌前损伤模型，并首次使用激光切割技术，结合连续切片的免疫组化方法，观察大鼠短期致癌模型中，直接证明了肝脏转化灶内肝细胞和灶外肝细胞 GST-P 和 CYP450 及亚型蛋白表达的差异。同时还利用该模型评价了一些具有潜在抗肿瘤活性的药物，发现中药白藜芦醇具有
37、明显的肝细胞癌前病变保护作用，其机制可能与其抗氧化和降低 CYP2E1 表达，从而减少 GST-P 转化灶的数量和面积作用密切相关，CYP2E1 可能在其中起到重要作用。参考文献：1 Ito N, Hasegawa R, Hagiwara A . 1997. Medium-term rat liver bioassay for rapid detection of hepatocarcinogenic substances. J. Toxicol. Pathol.10:1-112 Imai, T Masui T, Ichinose, M et al. Reduction of glutathi
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