1、ICSDB 41河 南 省 地 方 标 准DB 41/T XXXXXXXXX饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法（征求意见稿）XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施河 南 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB41/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南海瑞正检测技术有限公司提出。本标准由河南省畜牧局归口。本标准起草单位：河南海瑞正检测技术有限公司。本标准主要起草人：兰尊海、单慧燕、易善平、薛宁、许亚楠、李培娜、孙世雯。本标准参加起草人：贾锐锐、刘丽芳、邓晓宇、常胜辉、许红卫。本标准为首次发布。DB41/T X
2、XXXXXXXX1饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法 1 范围本标准规定了饲料中氨基酸的测定方法。本标准适用于蛋白饲料原料、饲料、饲料添加剂中氨基酸含量的测定。酸水解法中常规水解法适用于除色氨酸外其它氨基酸的测定；碱水解法只适于色氨酸的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 603-2002 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 10648 饲料标签GB/T 14699.1 饲料 采样GB/
3、T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定3 方法原理蛋白质在盐酸作用下，水解成氨基酸，水解后的氨基酸与衍生试剂反应，形成稳定的黄色衍生物经色谱柱分离，与氨基酸混合标液比较按外标法计算样品中各氨基酸含量。4 试剂和材料4.1 盐酸溶液，c(HCL)=6 moL/L：将优级纯盐酸与水等体积混合。4.2 衍生溶液：称取 1 g 氟苯于 100 mL 容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度。4.3 衍生缓冲液：称取 21.0 gNaHCO3于 500 mL 烧杯中，加 470 mL 高纯水溶解过滤，加 30 mL 乙腈于 500 mL 试剂瓶中。4.4 平衡缓冲液：称取 KH2PO43.4 g，加 0.1
4、 moL/LNaOH 溶液 145.5 mL，高纯水定容至 500 mL，摇匀，抽滤，贮存于棕色瓶中。4.5 氨基酸流动相浓度：称 164 g 无水 NaAc，4.0 g NaN 3（叠氮化钠），加 3500 mL 高纯水，400 mLN-N-二甲基甲酰胺，用 20%冰乙酸调 pH=6.4。4.6 混合氨基酸标准工作液，购买市售的氨基酸标准溶液，或称取单个氨基酸标准品（纯度98%），配制成约 100 g/mL 的混合标准溶液。4.7 氢氧化钠溶液，c(NaOH)=5 moL/L：称取氢氧化钠 200 g，用水溶解并稀释至 1000 mL。4.8 L-色氨酸标准工作液：准确称取 L-色氨酸标准品
5、约 10.00 mg，加少许水和数滴 0.1 moL/L 氢氧化钠，使之溶解，定量地转移至 100 mL 容量瓶中，加水至刻度。4.9 乙腈（色谱纯）。DB41/T XXXXXXXXX24.10 碳酸氢钠（分析纯）。4.11 磷酸二氢钾（分析纯）。4.12 无水醋酸钠（分析纯）。4.13 N-N-二甲基甲酰胺（色谱纯）。5 仪器设备5.1 实验室用样品粉碎机。5.2 样品筛：孔径 0.25 mm。5.3 分析天平：感量 0.0001 g。5.4 电热真空干燥箱。5.5 真空泵。5.6 喷灯。5.7 快速混匀器。5.8 高效液相色谱仪：附紫外检测器。6 样品采集与制备按GB/T 14699.1的
6、规定采样，取具代表性的饲料样品，用四分法缩分取25 g左右，粉碎并过筛0.25 mm孔径（40目）筛，充分混匀后装入自封袋中备用。7 检验步骤7.1 样品前处理7.1.1 酸水解法常规水解法：称取 0.1 g0.5 g 饲料试样（准确至 0.0001 g）于 20 mL 水解管中，加 10 mL 盐酸溶液（4.1）后封管。将水解管放在（1101）恒温干燥箱中，水解 22 h24 h。放至室温后，开管，过滤到 50 mL 容量瓶中，定容摇匀。7.1.2 碱水解法碱水解法：称取 0.4 g0.6 g 饲料试样（准确至 0.0001 g）于 20 mL 水解管中，加 10 mL 氢氧化钠溶液（4.7
7、）后封管。将水解管放在（1101）恒温干燥箱中，水解 22 h24 h。放至室温后，开管，先用 10 mL 的盐酸溶液（4.1）转移至 50 mL 容量瓶中，再用水转移定容摇匀，干过滤。7.2 样品测定7.2.1 测定取样 10 L 于小试管中，抽干，加衍生缓冲液 20 L，混匀，再加衍生试剂 20 L，混匀，封口膜封口，于烘箱中 60 衍生 30 min。取出放至室温，加平衡缓冲液 160 L 至总体积 200 L，混匀。分别取标准品和样品，按照（7.2.2）色谱条件操作，注入液相色谱仪，得标准品和样品溶液中各氨基酸的峰面积，按外标法计算样品中各氨基酸含量。7.2.2 色谱条件 DB41/T
8、 XXXXXXXXX37.2.2.1 色谱柱：C 18柱（长：250 mm，内径：4.6 mm，粒径 5 m）。7.2.2.2 流动相：A-0.05 moL/L 醋酸钠溶液 B-乙腈 C-高纯水。洗脱梯度见表 1。表 1 洗脱梯度序号 时间 min A% B% C%1 0.0 84.0 8.0 8.02 0.3 84.0 8.0 8.03 4.0 69.0 15.5 15.54 9.5 64.0 18.0 18.05 17.0 45.0 27.5 27.56 28.0 40.0 36.0 24.07 34.0 0.0 60.0 40.08 38.0 0.0 60.0 40.09 39.0 84
9、.0 8.0 8.010 46.0 84.0 8.0 8.07.2.2.3 流速：1.20 mL/min。 7.2.2.4 柱温：25 。 7.2.2.5 检测波长：360 nm。7.2.2.6 进样量：10 L。8 分析结果的表述8.1 结果计算样品中的组分含量按下列公式计算： 10imsVsP1CXX1-试样中各氨基酸的含量，%；Pi-试样溶液的峰面积；Cs-标准溶液的浓度，g/mL；V-样品溶液稀释的倍数；Vs-标准溶液进样体积，uL；Ps-标准溶液的峰面积；m-试样质量，单位 g；Vi-试样溶液的进样体积，uL。8.2 结果表示以两个平行试样测定结果的算数平均报告结果，保留 2 位有效数字。9 允许差DB41/T XXXXXXXXX4两个平行试验测定值的相对偏差不大于4.00%。_
