1、限制酶的多种切割方法一、错位切割含目的基因的 DNA 片段和运载体形成黏性末端1. 单酶切（1） 同一种限制酶分别切割含目的基因 DNA 片段与运载体。这是最简单的一种方法，含目的基因的 DNA 片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组 DNA 分子。（2）用同裂酶去切割含目的基因 DNA 片段与运载体。有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。2009 年江苏生物高考第 34 题就出现了同裂酶（BamH与 Bst），其中的差别只在于当识
2、别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。（3）用同尾酶切割含目的基因 DNA 片段与运载体。有一些来源不同、识别的核苷酸顺序和切割位置各不相同，但能产生相同的黏性末端，这类酶被称为同尾酶。常用的限制酶BamH、Bgl、Bcl和 Sau3A 就是一组同尾酶，它们切割 DNA 之后都形成由 GATC 四个核苷酸组成的黏性末端。显而易见，由同尾酶所产生的 DNA 片段，是能够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。【例 1】 （2005 年天津理综）：限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的
3、基因的两侧各有 1个酶的切点。请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。在 DNA 连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？解析：这两种酶属于同尾酶，能产生相同的黏性末端，因此能够连接起来。由于两者产生的黏性末端相同（都是 GATC），黏性末端之间能发生碱基互补配对而连接。（4） 单酶切的优点与缺点。单酶切优点就是操作简单。它的缺点主要有两个：酶切后的质粒与目的基因在 DNA 连接酶作用下易自身环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的两侧各有一个黏性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基
4、因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状 DNA 分子，其中质粒又恢复成没有切割前的样子。目的基因与质粒的任意连接：因为目的基因的插入是要有正确的方向才能正确表达，如果载体和目的基因的酶切是使用同一种限制酶，那么目的基因的插入就有两种可能了。一种可能是目的基因的最前端刚好插在启动子邻接下游，这样可以正确表达；另一种刚好相反，目的基因的末端插在启动子的邻接下游（也就是将目的基因翻转 180 度之后插入进去的），目的基因则没有办法表达。这样就容易形成两种重组 DNA 分子，其中一种重组 DNA 分子是我们所需要的，这样就加大了筛选工作量。由此可见，将同一种限制酶切割目的基因与质粒可以获得两种重组质粒，
5、不能使质粒与目的基因发生定向连接。2.多酶切（1）用两种或两种以上的限制酶去切割含目的基因的 DNA 片段和运载体。较常见的是用同一组两种限制酶去切割含目的基因的DNA 片段和运载体，两者都会产生具有两种不同的黏性末端的 DNA片段（两个末端分别用 A 与 B 表示），然后混合起来，那么载体分子的 A 端与目的基因的 A 端连接，载体分子的 B 端与目的基因的 B端连接，这就形成了重组 DNA 分子。另外，还可以用不同组限制酶同时去切割含目的基因的 DNA 片段和运载体，此时要用同尾酶或同裂酶去切割。【例 2】 （2009 年福建理综）：转基因抗病香蕉的培育过程如下图所示。质粒上有 Pst、S
6、ma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答：构建含抗病基因的表达载体 A 时，应选用限制酶，对进行切割。解析：题中抗病基因的两侧分别是 Pst和 EcoR的酶切位点，因此只能用这两种酶去切割。目的基因两侧的黏性末端是 P 和 E，为了让目的基因与运载体结合，运载体两侧的黏性末端也只能是 P和 E，因此也只能用 Pst和 EcoR酶去切割质粒。不能单独使用Sma酶去同时切割目的基因与质粒的原因是 Sma的酶切位点正好在目的基因的中间，如果单独用此酶切割会破坏目的基因的结构。因此，答案是选用限制酶 Pst和 EcoR对含抗病基因的 DNA 片段与质粒进行切割。（2）多酶切的优缺点。多酶切的
7、优点是可以克服单酶切的两大缺点，一是可防止目的基因与质粒的自身环化：多酶切后目的基因与运载体的两侧的黏性末端不相同，因此不能发生自身首尾相连成环状 DNA 分子。二是可实现目的基因与质粒的定向连接。比如说紧靠启动子下游的是 Pst的酶切位点，而 EcoR位点在后面，目的基因的前端是 Pst位点，末端是 EcoR位点，酶切之后插进去，就可以保证目的基因的前端刚好插到紧靠着启动子的下游，只产生一种重组质粒，目的基因实现定向插入，这样就可以顺利表达。2010 年江苏生物高考第 27 题的第 4 小题就考查了多酶切的优点。多酶切的缺点是要用多种酶切割，由于每种限制酶的作用的条件不同，或是说最适 pH
8、和温度的不同，一般不能将一组的两种酶放在同一操作环境中使用，而是要进行两次操作，更换操作液，以保证酶的高效性。因此，使用多酶切的方法在实际操作中较复杂。二、平位切割含目的基因的 DNA 片段和运载体形成平末端（1）用相同或不同的限制酶切割含目的基因的 DNA 片段和运载体。如果限制酶切割方式是平切，产生的末端是平末端，则可用相同或不同的限制酶分别切割含目的基因的 DNA 片段和运载体，因为两个不同的平末端在 DNA 连接酶的作用下可以任意连接，具体的原因是 DNA 连接酶连接的仅仅是 DNA 双螺旋结构外侧的骨架，即磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键和碱基无关。在 2008 年江苏生物高考第 32
9、 题的第 5 小题中就有考查关于平末端任意连接的知识点。（2）平位切割的优缺点。由于两个不同的平末端在 DNA 连接酶的作用下可以任意连接，这样就不需要含目的基因的 DNA 片段和运载体具有相同的限制酶识别序列，减少了对运载体的挑选和改造的工作量。而且对于非互补的黏性末端，可以采用绿豆核酸酶等将其单链削平或补齐，使它变成平末端，然后进行连接。在实践中，极少用平末端，因为平末端的连接效率比较低，只有在找不到合适切成黏性末端的酶切位点而有平末端切口的情况下才使用。总之，以上几种酶切方法在近几年的生物高考题中都有所体现，都有各自的优缺点，在解题时要根据题目中的要求进行酶切方法的选择，要学会灵活运用知识，这样才能在高考中拿到高分。
