1、内部资料 密级：保密 发酵法年产 100T 番茄红素微胶囊项目可 行 性 研 究 报 告济宁蓝海生物科技有限公司二一一年九月十日 1. 总 论 1.1. 概述 番茄红素是人们膳食中一种类胡萝卜素，主要来自番茄和番茄制品。它是许多类胡萝卜素合成的中间体。类胡萝卜素是由细菌、藻类和植物生物合成的类萜烯，动物无法自己合成，只能从食物中摄取。番茄红素不仅是天然的色素，还具有较强的抗氧化、防癌抗癌的作用，被誉为神奇的“功能性天然色素” 。研究发现，在前列腺癌、胃癌、皮肤癌和宫颈癌的患者中，大量食用番茄的比不食用的少 50%以上。因此，番茄红素已被广泛用于医药、食品、饮料、保健和高级化妆品等行业，预计我国
2、仅保健品一项年需求量就将达到750 吨，加上用于医疗和食品方面，国内对番茄红素的年需求量将达到 1000 吨以上，市场前景极为广阔。本项目采用微生物发酵法生产新一代“功能性天然色素”番茄红素。该技术来源于北京化工大学和北京海斯夫生物技术有限公司。其中北京化工大学袁其朋教授通过菌种选育获得了高产稳定的生产菌株 BY-2 （专利申请号 200510090996.0） ，北京海斯夫生物科技有限公司对该菌株的发酵生产工艺、产物提取分离、制剂工艺进行了生产试验性开发。目前该生产工艺中番茄红素的发酵单位最高达到了 2g/L，得到的番茄红素晶体纯度达到了 96%以上，技术水平处于国内领先地位。 本项目的产业
3、化实践过程中，将建立一套完整的采用丝状真菌三孢布拉霉进行发酵制备天然番茄红素的工艺。本方法包括：a.一级种培养；b.二级种培养；c.发酵；d.提取；e，制剂付型。其特征是：一级种子培养时，将保藏在土豆葡萄糖琼脂培养基斜面上能代谢产生番茄红素的三孢布拉霉两性菌种，分别接入装有种子培养基的三角烧瓶中，在 2430、160180 转/分钟条件下，进行振荡培养 4448 小时；种子经二级放大后，将分别培养好的三孢布拉霉两性菌种的种子发酵液按 1 1 的比例混合后，接入发酵罐发酵生产。在发酵过程中添加氧载体与代谢阻断剂，以提高产品的发酵单位，最终可使番茄红素含量达到 1.5-2g/L。采用工业化放大操作
4、性强的溶剂提取工艺。产品制剂付型时采用冷喷的工艺技术，加大限度的保留产品活性，延长保质期。 本项目的发酵水平在国内尚未有其他单位能实现，因而本项目关键技术的研发成功的彻底解决了国内番茄红素发酵生产的技术瓶颈。其产业化符合国家组织实施生物医药高技术产业化专项的目标和要求，对于推进发酵工业中代谢调控研发水平的提高，促进传统天然植物营养提取物的产业升级，提高我国天然食品色素和功能性食品添加剂的产业核心竞争力具有重要意义。项目总投资为 7600 万元，其中：固定资产投资 6736 万元。投产后形成年产 100 吨 6%番茄红素的产业化规模。达到年均营业收入 10100 万元，利润总额为 5611 万元
5、，项目投资税后财务内部收益率为 49.35%，税后静态投资回收期(含建设期)3 .5 年。 1.1.1 项目名称 发酵法生产 100T/a 吨番茄红素项目1.1.2 报告编制单位 济宁蓝海生物科技有限公司1.1.3 编制依据投资项目可行性研究指南 （试用版） ； 建设项目经济评价方法与参数 （第三版） ； 建设地点相关资料。 1.1.4 备案情况 暂未备案。 1.2. 项目提出的背景与意义 1.2.1. 产品性质、功能及作用机理 性质 番茄红素又名 -胡萝卜素，是一种开链式的不饱和胡萝卜素，为胡萝卜素和叶黄素生物合成过程中的中间产物，经两步环化反应后即为胡萝卜素。 其主要性质如下： （1）分子
6、式：C40H56，分子量为 536.88，针状深红色晶体（从二硫化碳和乙醇混合液中的析出物） ；熔点: 174，可燃。溶解性：不溶于水，难溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、己烷、丙酮，易溶于二硫化碳、氯仿、苯、沸腾乙醚、正己烷等有机溶剂。番茄红素的结构：番茄红素大约有 72 种顺反异构体存在，植物中存在的番茄红素几乎都是反式的，而在动物体内则顺式占多数。顺式异构体和反式异构体在物化性质上完全不同：顺式异构体颜色弱、熔点低、消光系数小，在紫外光谱中有一个新的吸收峰；反式结构耐热，熔点较高；另外加工工艺也会造成其异构化。全反式番茄红素是一种具有 11 个碳碳共轭双键的多不饱和脂肪族烯烃（见图 1
7、-1） ，溶于脂肪和油脂中并呈现红色。由于具有非环状结构，故不表现维生素 A 的生理活性。 图 1-1 番茄红素的全反式结构番茄红素的稳定性：番茄红素具有两大特点。 （l）易氧化性。光照、温度、与氧接触、pH 降低以及表面活性剂的作用均可使番茄红素发生降解；酸对番茄红素具有较强的破坏作用，而碱的影响则不大；（2 ）异构化性。番茄红素有 72 种顺式异构体结构。顺式结构与反式结构相比，物理化学性质的差异主要包括熔点的降低和消光系数的减小等，特别是消光系数的减小对于番茄红素的定量分析有一定的影响。在储藏和制备过程中，番茄红素的损失主要是由于发生氧化异构化和降解，因此要在低温、暗处保存，尽量避光。
8、生理功能及机理番茄红素是一种脂溶性类胡萝卜素，与 -胡萝卜素相比，它不是维生素 A 的前体，因而对番茄红素的早期研究主要集中在其热稳定性上。后来，随着人们对番茄红素生理功能的进一步认识，其生理功能及生产方法的研究逐渐成为热点之一。1989 年 Di Mascio 等发现番茄红素在所有的类胡萝卜素中具有最强的消除单线态氧的作用；1999 年 Minhthy L 等报道，与 胡萝卜素、胡萝卜素相比，番茄红素对癌细胞的生长具有更强的抑制作用；1995 年 Giovannucci 等的研究表明通过食用大量含有番茄红素的食品（新鲜番茄、番茄酱等）可减少前列腺癌的发病率。下面将对之进行详细介绍。1) 高效
9、猝灭单线态氧和清除自由基的作用 与类胡萝卜素及其它抗氧化剂相比，番茄红素的抗氧化作用主要表现在它能高效猝灭单线态氧及清除过氧化自由基。单线态氧 1O2 是一种很强的活性氧自由基，能跟许多与氧气不能发生反应的分子直接结合，从而造成对细胞的损伤。番茄红素在猝灭单线态氧的过程中，激发态的能量从单线态氧转移至番茄红素，产生基态的氧和激发的三联态番茄红素，能量则通过激发态的番茄红素与周围溶剂之间的转动和振动而散发，并产生基态的番茄红素和一定的热量。番茄红素对单线态氧的猝灭属于物理猝灭，番茄红素在这个过程中就像催化剂一样，只是加速其猝灭过程，而其本身保持完整状态，同时可不断参与下一个猝灭单线态氧的循环。
10、实验发现，番茄红素猝灭单线态氧的效率与其分子中所含有的共轭双键的数目有着密切的关系，番茄红素分子中有 11 个共轭双键，因此，与其它类胡萝卜素相比，番茄红素的猝灭效率特别高。番茄红素还可以与其它形式的活性氧起反应，如：过氧化氢、亚硝酸根等。番茄红素作为抗氧化剂的一个很好的例子是它能保护皮肤免受紫外光的损伤，皮肤受到紫外光照射时，皮肤中的番茄红素能优先与自由基结合，从而保护皮肤中的组织及细胞避免了因氧化造成的损伤。 2) 防癌、抗癌作用1994 年 Franceschi 等报道了食用大量的番茄可以防癌，1999 年 Giovannucci 在其综述中提到番茄红素对肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、乳
11、腺癌等癌症均有抑制作用，能够在细胞水平上抑制神经胶质瘤细胞、白血病细胞的增殖作用。美国哈佛药物学院和哈佛公众健康学院经过六年的时间分别对 47894 名男性作了详细研究，结果显示在 46 种水果和蔬菜中，只有番茄产品对前列腺癌具有可度量的抑制作用；日本的一个医学研究所对 4 个胃癌发病率不同的地区进行调查，测定居民血浆中维生素 A、B、C 和 胡萝卜素、番茄红素的水平，发现血浆番茄红素的浓度越高，胃癌发病率越低。虽然番茄红素对癌细胞繁殖的抑制作用在体外和动物的实验中均得以验证，但对于它具体的抗癌机理并不是很清楚，目前关于番茄红素的抗癌机理有：猝灭单线态氧和清除自由基，防止其 氧化损伤；促进细胞
12、间的正常结合；抑制癌细胞增殖因子的作用；活化免疫细胞的作用。近年的研究表明，番茄红素与 胡萝卜素一样，是防治疾病的重要功能因子。另外，番茄红素的许多具体功能有待进一步研究。 3) 防治血管硬化和冠心病作用 流行病学、临床医学、以及生化研究表明血清中低密度脂蛋白（ LDL ）的氧化可能会造成动脉硬化，故抗氧化作用在一定程度上可减缓动脉硬化的进程。番茄红素具有很强的抗氧化作用，它可以阻止低密度脂蛋白氧化物的形成，从而有效防治血管硬化；同时，番茄红素也阻止 DNA 和脂蛋白的氧化作用，故它在防治动脉硬化疾病过程中起重要作用。调查研究表明通过日常饮食所摄取的类胡萝卜素对减小冠心病的发病率和死亡率起重要
13、作用，而且血清和脂肪组织中番茄红素的浓度和患冠心病几率呈负相关关系。荷兰学者对心肌梗塞患者的检查中发现病人的番茄红素含量低于健康人，而且 和 胡萝卜素含量也比正常人体显著降低，以上这些均说明番茄红素对防治血管硬化和冠心病具有重要作用。 4) 在人体内的存在及其吸收特性 胡萝卜素和番茄红素是人体组织和血液中存在的主要类胡萝卜素。人体内的番茄红素不仅以全反式结构存在，还以 9顺、13顺、15顺的形式存在。有报道表明，人类从外界摄取番茄红素的过程中，用 1的玉米油热处理 1 小时的番茄汁要比未经处理的番茄汁易于吸收，这可能是由于番茄红素是脂溶性类胡萝卜素以及热处理会破坏细胞壁的结构，增强番茄红素的生
14、理活性；而且他们还发现服用热处理过的番茄汁 2448 小时后，人体血清中番茄红素的浓度达到峰值，但食用未经处理的番茄汁则不会出现上述现象。这些现象说明，经过处理的番茄红素制品更有利于人体的吸收。1.2.2. 产品用途、市场概况 产品用途 国外番茄制品除传统的番茄酱（Tomatosauce） 、番茄汁（Tomato juice）外，现在向功能性生物制品发展，番茄红素主要被运用于如下几个方面。 1) 用于防止紫外线灼伤，保护皮肤的产品上商品名LYC-O-MATO Sunscreen factor 8 Solar Health Clear Complexin Lifessential Sin Eha
15、nceSeresis Cell Protection 主要成分Lycopene、VA、VELycopene 、 -Caroten、Grape seed、Bioflavonoids 、Zn 、 VE、 VC Zn、Lycope 。-Carotene、VE 用途（UVA、UVB ）灼伤健肤 健肤、润肤 生产商Ultimate PharmaProductsBullivant s NaturalHealth Products Pty Ltd BullivantsNaturalHealth Products Pty LtdKorded PtyLtdPharmation Natural HealthPro
16、ducts 国别以色列 澳大利亚 澳大利亚 澳大利亚 瑞士备注是以一种油树脂（Oleoresin）的形式提供或其胶囊，能够较好的被人体吸收。 表 11 国际市场番茄红素护肤用品2) 用于预防前列腺癌的产品 主要有一下几个公司出产：Twinlab、Jules、Meta Pham、Wakunage of CO.Ltd，典型产品有：Lycosoy Postrate Protector （60 粒胶囊） Twinlab （美国） ；Prostate Health （90 粒胶囊）Jules （美国） ；DuoConfort （40 粒软胶囊）Meta Pham （法国） ； Kyolic Prosta
17、Logic （ 60 粒胶囊） Wakunage of gmerica CO Ltd （美国） ； Jarrow prostate optimizer (60 粒胶囊) Jarrow Formulas Inc. 3) 用于番茄红素功能性产品 生产这类产品的厂家很多，产品类型也较多，这类产品已得到FDA 的认证。国际著名公司共有五家，分别是：Jarrow Formulas Inc；Nature s Herbs；Twinlab； Naturals ；LyoRed。 4) 用于类胡萝卜素复合产品 该类产品主要与 、胡萝卜素、叶黄素合用于功能食品，为 Solgar 公司出品，主要产品如下：Lycope
18、ne Carotenoid Complex Vegicaps （15mg，30 粒胶囊） Solgar；Saw Palmetto Pygeum Lycopene Complex Vegicaps （4mg50 粒胶囊）Solgar 营养品或保护前列腺；Lutein Lycopene Carotene Complex Vegicaps （5mg，30 粒胶囊）Solgar 抗氧化剂。 其实早在 20 世纪 50 年代，美国的科学家就首次报道番茄红素具有抗癌功效。2001 年由美国瑞琦生物科技实验室（RICHLIFE LABS ）和美国加洲癌症预防研究中心领导的科研小组研制的口服复方番茄红素片（L
19、ycopene Plus来托康）顺利通过 FDA 认证，在欧美地区再次掀起了更大的“红色风暴” 。 “来托康”突破了传统的生产工艺极限，是番茄红素产品发展过程的一场革命，它的番茄红素含量为 6mg/片，是近乎一筐新鲜番茄所能提取出的数量。 番茄红素作为天然色素已在全世界范围内被广泛接受，但由于对天然色素这一概念的界定存在差异，各国间并无统一的尺度。欧共体很早以前就允许使用番茄红素，但仅限于天然的番茄红素作为食品着色剂。由于其在各种植物体内含量均较低，故而一直未能商业化生产。日本也有一种商品番茄红素，Lycopene 含量为 5 土 0.25%，为红褐色液体。目前最大的生产高含量番茄红素的西红柿
20、提取物的工厂位于以色列，他们的产品是纯天然的，可以作为营养补充剂和食用色素。目前对番茄红素提取物的商业品质通常要求 Lycopene 含量 3。90-95纯品番茄红素，其出口售价约人民币 5000 万元/t，以色列的报价为 6000 美元/kg 。 市场概况 目前番茄红素产品主要销往欧美等国，年需求量超过 1000 吨。有多家代理商代理该产品的出口。5%含量的产品价格约为 150 万元/吨。 1.2.3. 项目的意义与必要性 对上游医疗保健品的推动作用 番茄红素具有独特的长链分子结构和比其它类胡萝卜素多的 13 个双键，因而具有较强的抗氧化能力，是类胡萝卜素中淬灭单线态氧和引起衰老、病变的自由
21、基能力最强的一种色素，其生理活性是 VE 的 100 倍，-胡萝卜素的 2 倍，同时番茄红素还具有细胞间信息感应和调控细胞生长的作用，具有抑制低密度脂蛋白的氧化和抗紫外线作用，是一种新型的功能性天然色素。 该产品上市后，可增加治疗、预防癌症的可选药物，对于医疗卫生事业的发展有着积极影响。并且该产品来源于天然，无不良副作用，不同于现行的癌症治疗药物，代表着一种治疗药物发展方向。对相关天然色素行业的发展带动作用 过去天然色素是天然植物提取物的一种。天然植物营养物的提取，破坏着大量的植物、森林资源，可供种植的营养物质的提取又存在与粮争地，与人夺食的客观现实。在 2008 年爆发世界性粮食危机以来，已
22、经向以消耗粮食资源为代价的生物能源、生物材料、生物化工行业敲响了警钟。 本项目采用微生物发酵法生产番茄红素，不与粮争地，而且节约了为提取番茄红素而用于种植番茄的土地，其产业的实施，必然推动天然植物提取业发展，提出以不破坏资源为途径的可持续发展的新道路。推动天然色素化合物平台建设，加速天然色素产业化 天然色素是指天然动、植物中的有色化合物。由于来源于生物体，天然色素色泽逼真，安全性高，而且有的天然色素除具有着色功能外，还兼有重要的生物功能。利用微生物发酵生产天然色素，生产周期短、不受场地和季节限制，已引起了人们的广泛重视。微生物生产天然色素是生物技术领域的新兴产业，但是许多产业技术尚不完善，成套
23、的加工工艺尚待解决。 本项目实现后将组建国内首家专业利用微生物生产天然色素的技术平台，创立完整的微生物生产、提取、分离、纯化天然色素及其制剂成套工艺。打造出一个具有国际竞争力的色素企业，以天然色素的基础理论及应用技术研究为企业发展的核心竞争力，推动国内天然色素产业化进程。1.3. 研究的结论及建议 番茄红素是一种新兴的天然功能性色素，具有延缓衰老，防 癌抗癌的保健作用；其步入市场后可以提高人们生活质量，预防疾病；并且该项目利用大发酵法生产，不依赖于自然资源，不破坏环境，不与粮食竞争，比直接提取法， 。化学合成法更具节能、环保的优点。 该项目采用代谢调控的办法，大大提高了发酵水平，其产量可与国际
24、同行比肩，生产成本低廉，产品竞争力高。 项目采用的环保治理，安全卫生，消防设施完善、合理，建成后对当地生态和环境不会构成太大冲击。 2、技术先进性2.1. 传统生产工艺及存在的问题 由于番茄红素具有卓越的防癌、抗癌以及防治心脑血管疾病的功能，研究人员在深入研究其治病机理的同时，也在致力开发番茄红素的生产工艺。迄今为止，已见于报道的生产工艺主要有天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。2.1.1. 天然提取法 天然提取法主要是利用番茄红素的脂溶性性质，从富含番茄红素的植物中提取而获得产品。提取方法主要包括有机溶剂提取法、微波萃取法、直接粉碎法提取、超临界 CO2 萃取法及酶法。但由于番茄中所含番茄
25、红素较低 （10mg/100g） ，即使是我国产量最丰富的新疆地区所生产的番茄也只含有 20mg/100g 左右，因而天然提取法价格昂贵、产率低、受产地及季节限制，无法满足市场需求2.1.2. 化学合成法 化学合成法生产番茄红素较成功的主要是德国的罗氏公司和巴斯夫公司。1997 年 10 月，罗氏公司完成了工艺开发并在欧洲提出专利申请。该工艺由三苯基氯化磷和辛三烯二醛用甲醇在 2-丙醇中进行烯化反应，制得番茄红素的收率为 65%。罗氏公司将在瑞士的一个生产基地用合成工艺批量生产番茄红素，并用罗氏开发的微囊技术，微囊化工艺生产不同的番茄红素制品。德国巴斯夫公司也看到了番茄红素不可估量的市场潜力，
26、投入力量进行研究开发，1997 年 8 月完成了合成工艺开发，并在欧洲提出专利申请。该工艺由三苯基甲磺化磷与辛三烯二醛反应制得番茄红素，产品已面市。该法虽已实现工业化，且价格便宜，但随人们对绿色食品的要求逐渐趋于不利地位，目前该法生产的番茄红素主要用作饲料。 2.1.3. 微生物发酵法 由于番茄中的番茄红素含量较低（10mg/100g） ，即使是新疆产的也只有 20mg/100g 左右，且天然提取法价格昂贵、产率低，无法满足市场需求。因而利用微生物发酵法生产番茄红素一直是国内外研究的热点之一。微生物发酵法主要是利用藻类真菌、酵母菌 S.cerevisiae 、酵母菌 Candida. Util
27、is、Escherichiacoli 菌、毛霉属菌 Phycomyces、 Blakeslea trispora、Choanephora 以及基因工程菌等微生物发酵生产番茄红素。迄今为止，能够生产番茄红素的微生物包括能自身合成番茄红素的革兰氏阴性菌（Erwinia uredovora 和 Erwinia herbicola） ，毛曲霉属（如三孢布拉氏霉菌 Blakeslea trispora、Phycomyces、Choanephora） 、 酵母菌以及基因工程菌。其中 Blakeslea trispora 是研究最多，也是目前唯一能够实现胡萝卜素工业化生产的菌株，本实验室就是采用此菌种作为番
28、茄红素的生产菌。 2.2. 本项目生产工艺 发酵法生产番茄红素所用的菌有基因工程菌和三孢布拉氏霉菌，采用基因工程菌发酵法生产番茄红素的方法现仍处于小试水平，且产量很低，距工业生产尚有很大距离。三孢布拉氏霉菌（B. trispora）在工业上用于 -胡萝卜素的生产，目前报导的发酵单位可达 3.5g/L 发酵液。人们对 -胡萝卜素的代谢途径进行了系统的研究，发现三孢布拉氏霉菌主要通过甲羟戊酸途径合成 -胡萝卜素，具体代谢途径如下： 图 1 三孢布拉氏霉菌中类胡萝卜素合成途径根据 -胡萝卜素的代谢途径，番茄红素是其生物合成的中间代谢产物。因而，如能在发酵过程中阻断番茄红素向 -胡萝卜素的环化反应，即
29、可得到番茄红素。以此为基础，俄罗斯科学家 Gavrilov 等开发了利用烟草废弃物阻断番茄红素向 -胡萝卜素的转化以制备番茄红素的工艺，番茄红素发酵单位为 760mg/L。本课题组对用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素进行了系统的研究，通过菌种选育得到了高产菌株，通过发酵条件优化使番茄红素发酵单位达 1026 mg/L 。主要工作如下： 2.2.1. 建立了三孢布拉氏霉菌筛选、诱变程序 三孢布拉氏霉菌（B. trispora ）是一种丝状真菌，在平板上培养时，菌丝在生长初期迅速蔓延至整个平板，无法进行分离。根据文献报道1，B. trispora 在传代过程中极易发生高表达能力的缺失，菌体退化，而且
30、退化特征会向正常菌株发生不可逆传递。鉴于此，建立一套简易快捷的菌种筛选、诱变程序具有重要的意义。 在研究中通过向培养基中添加适宜浓度的脱氧胆酸钠，建立了适合 B. trispora 的筛选培养基；在总结大量实验的基础上，制定了根据菌体形态所获得的高产菌株的筛选标准，建立了筛选程序，并对筛选结果进行了验证；采用化学法与物理法相结合的方式对 B. trispora (-)菌进行诱变处理，建立了一套适合于(-)菌的诱变程序，为获得稳定的番茄红素高产菌株提供了技术基础。 2.2.2. 研究了阻断剂的添加对产番茄的影响 阻断剂添加降低了甲羟戊酸途径的代谢通量进而降低了番茄红素的发酵单位：我们在研究过程中
31、发现，同一株菌，在最优条件下，其 - 胡萝卜素的发酵单位可达 3.5g/L，但添加阻断剂后，菌丝体干重基本不变，番茄红素的发酵单位却仅为 1026 mg/L。说明阻断剂的添加，不仅阻断了番茄红素向 -胡萝卜素的转化，同时也对其原有代谢途径产生影响，降低了番茄红素的代谢通量，使番茄红素的发酵单位降为 -胡萝卜素生产能力的 1/3。Gavrilov 等的研究结果也证明了我们的推断。 2.2.3. 代谢调控研究麦角固醇旁路代谢降低了番茄红素的代谢通量：我们在研究过程中发现加入角鲨烯合成酶抑制剂特比萘酚等化学阻断剂可以减少麦角固醇的合成，促进代谢流向番茄红素方向迁移，进而增加番茄红素的产量。干菌体中麦
32、角固醇的含量减少了 16.7%，干菌体中番茄红素含量则提高了 23.78%。说明在分支点处降低角鲨烯合成酶的活性，可促使代谢流向聚异戊二烯基焦磷酸迁移并最终促进番茄红素的合成。2.2.4. 溶氧水平对产番茄红素的影响溶氧水平不足降低了番茄红素的发酵单位：三孢布拉氏霉菌为耗氧真菌，且代谢旺盛，生长速度快，产物合成过程中对氧气消耗大，本实验室研究表明番茄红素的发酵单位随溶氧水平的增加而增加。因此，解决发酵过程中氧气供应是三孢布拉氏霉菌发酵中亟需解决的问题。 在研究中我们筛选得到了适用于三孢布拉氏霉菌的氧载体，通过添加氧载体以增大溶氧水平，进而提高了番茄红素的发酵单位。 2.2.5. RNA 干扰技
33、术平台的建立 迄今为止，利用 RNAi 技术沉默番茄红素环化酶的基因以及将角鲨烯合成酶抑制剂用于阻断麦角固醇途径以促进番茄红素合成的研究尚未见有报道。本课题组近年来利用现代分子生物学技术及医学领域的研究结果，依据代谢工程原理，对通过代谢调控以大幅度提高番茄红素的发酵水平进行了系统的研究，取得了以下创新成果：番茄红素环化酶基因的 RNAi 技术：利用高效、特异性的 RNA i （RNA interference ）技术沉默番茄红素环化酶基因，代替阻断剂的添加，从而达到了提高番茄红素发酵单位的目的。 通过上述研究，我们已成功地开发了发酵法生产番茄红素的新工艺，在 500L 发酵罐中中试成功，技术成
34、果经北京市科委组织坚定，达到国际先进水平，并申请了发明专利（已公开） ，产品经中国农科院检测，超过国外同类产品标准。 2.3 特点及优势 利用三孢布拉氏霉发酵生产番茄红素主要通过添加番茄红素环化酶的抑制剂（烟草）来实现，但烟草的添加降低了类胡萝卜素的代谢通量，番茄红素的发酵单位也大幅度降低。至目前为止，尚未见有在三孢布拉氏霉菌中进行 RNAi 的报道。本课题首次将 RNAi 技术应用于番茄红素环化酶的沉默，可省去烟草的添加，从而大幅度提高番茄红素的发酵单位；借鉴医学领域降胆固醇药物的作用机制，在三孢布拉氏霉中首次通过添加由法尼基焦磷酸至麦角固醇合成过程中的酶抑制剂以减小代谢流向麦角固醇的迁移，
35、从而增大番茄红素合成的代谢流。这项研究国内外均未见有报道，因而具有创新性；筛选得到了适用于三孢布拉氏霉菌的氧载体，通过添加氧载体以增大溶氧水平，进而提高了番茄红素的发酵单位。 与国内外现有技术相比，本生产工艺具有如下特点和优势： 利用三孢布拉氏霉发酵生产番茄红素主要通过添加番茄红素环化酶的抑制剂（烟草）来实现，但烟草的添加降低了类胡萝卜素的代谢通量，番茄红素的发酵单位也大幅度降低。至目前为止，尚未见有在三孢布拉氏霉菌中进行 RNAi 的报道。本课题首次将 RNAi 技术应用于番茄红素环化酶的沉默，可省去烟草的添加，从而大幅度提高番茄红素的发酵单位。借鉴医学领域降胆固醇药物的作用机制，在三孢布拉
36、氏霉中首次通过添加由法尼基焦磷酸至麦角固醇合成过程中的酶抑制剂以减小代谢流向麦角固醇的迁移，从而增大番茄红素合成的代谢流。这项研究国内外均未见有报道，因而具有创新性； 筛选得到了适用于三孢布拉氏霉菌的氧载体，通过添加氧载体以增大溶氧水平，进而提高了番茄红素的发酵单位。 3、建设方案3.1. 产品方案与建设规模根据对市场供需情况的分析和预测，结合项目单位自身的资源占有量、技术设备条件、配套条件落实情况等，确定本项目的产能规模为年产 6%番茄红素 55 吨，生物有机肥 500 吨。本项目的产品组成和规模见表 3-1。 表 3-1 产品品种、规模（吨/年）序号 项目及产品 项目规模 产量 1 6%番
37、茄红素 100 1002 麦角固醇或生物肥料 10 麦角固醇/50 吨生物 5003.2. 技术方案3.2.1. 生产工艺路线：生产工艺路线如下图 3.2.2. 工艺路线叙述利用三孢布拉霉生产番茄红素分为四个工艺段，分别如下： 发酵工段此工段包括两部分，种子培养和发酵培养。种子培养工艺是将保藏的生产菌株经过两次活化培养后，将阳性菌株和阴性菌株分别经种子发酵罐放大成可接种的种子。发酵培养时，首先将发酵原料按照发酵培养基配方配制，121灭菌 30min，待发酵罐内温度降至 30时，将起先分别培养好的阳性、雌性种子以一定比例混合接入生产发酵罐培养 100-120h。在生产罐培养时，不断检测菌体生长量
38、，番茄红素产量，适时根据番茄红素合成情况和发酵罐内培养基的成分变化适时添加阻断剂和进行补料、pH 值调整，当发酵后期番茄红素含量不再增加，停止培养，进入提取工段。提取工段首先将发酵成熟的培养液，加入助滤剂，过滤收集菌体。将收集到的菌体烘干后，破碎细胞，直接加入溶媒进行回流萃取，反复萃取两次，合并萃取液。萃取液可直接浓缩，得到番茄红素浸膏。浸膏进入制剂付型工段，提取过程中的溶媒可直接进入溶剂回收车间进行回收精制，萃取番茄红素后的废菌丝体可直接加工成生物肥料。 制剂付型工段番茄红素浸膏可经过柱层析、结晶等步骤精制成为 90-95%的番茄红素纯品，也可经过冷喷工艺，直接加工成 6%的番茄红素微胶囊。
39、 溶剂回收工段浓缩浸膏过程中的馏出液中含有大量有机溶剂，须经过溶剂回收车间，进一步纯化精制，方可达到可重复利用的标准。 3.3. 主要采用的设备 3.3.1. 主要工艺设备选型原则 设备选型依据工艺要求和建设规模，本着“成熟、可靠、先进、经济”的原则选型。1) 所选设备技术性能先进，应达到目前国内先进水平，经生产厂家使用证明其运转稳定可靠，能够满足生产高质量产品的要求。 2) 设备性能价格比合理，使投资方能能够以合理的投资获得生产高质量产品的设备。 3.3.2. 设备情况1)充分考虑设备的正常运转费用，以保证在生产相同产品时，能够保持最低的生产成本。2)选用生产设备厂家具有国内一流装备，管理科
40、学，达到国际质量认证标准。3)对生产设备进行合理配置，充分发挥各类设备最佳技术水平根据工艺要求和建设规模的需要，本项目拟投资 1799.15 万元购置种子罐、发酵罐、干燥塔等设备、仪器设备共 75 台（套） 。具体设备见表 3-2、3-3 。 本项目生产工段中主要采用的设备见表 3-2：表 3-2 生产阶段主要的设备编号 设备名称 型号与规格 单价（万） 数量（个） 合计发酵罐 20 m3 33 12 3963m3 5.4 12 64.8500L 3 12 361100L 1.6 12 19.22 板框过滤机 BAS 40 平米 16 8 1283 真空干燥箱 10 M3 38 4 1524
41、粉碎机 干物料处理能力 100 公斤/小时36 2725 搅拌提取釜 10 吨 17 2 346 回流塔 5003000mm 不锈钢34 26820 m ，304 不锈钢 29 2 5810 m ，304 不锈钢 24 4 967 储罐10 m3 ，304 不锈钢 16 5 808 真空泵 40mmHg，抽气量大于 10 m /h29 41169 管道泵 3.6 12 43.210 反应罐 10 m3 ，搪瓷或不锈钢 16 2 3211 纯化 500 2000mm，内衬四氟28 411212 蒸馏釜 10 m3 ，不锈钢 20 1 2040m2 15 2 3013 冷凝器10m 4 2 814
42、 纯水机 8 吨/小时，电导率小于 10 s/cm34 13415 锅炉 产蒸汽 4 吨/小时，温度 20080 18016 制冷机 致冷量 22 万大卡 70 1 7017 空压机 150 m3/分钟 140 6 84018 喷雾干燥塔 1000Kg/h 300 1 30019 包装机 3000 袋/h 20 1 2020 发酵控制系统PLC 控制 170合计 116 台/套 2979.2本项目主要采用的化验设备见表 3-3： 表 3-3 主要化验设备 编号设备名称 型号与规格单价（万） 数量（个） 合计1 冰箱 海尔 0.3 2 0.62 全温摇床 上海欣蕊 2.7 2 5.43 培养箱
43、上海 0.4 2 0.84 灭菌柜 上海 3.5 2 75 超净工作台 北京昌平 0.8 2 1.66 高效液相 waters & UV35 1 357 紫外可见连续扫描仪上海 10 1 108 离心机 Sigma 6 2 129 显微镜 nikon 4 2 8合计 16 80.43.4. 工程方案3.4.1. 设计依据 （1） 建筑设计防火规范GB50016-2006； （2） 建筑抗震设计规范GB50011-2001； （3）其它现行的有关国家规范。3.4.2. 设计标准 本工程根据生产厂房的生产类别，严格按照建筑设计防火规范划分防火分区，按规定设置足够数量的安全出口。本项目总建筑面积 15769m2，建筑物占地为 7397.5m2。车间生产类别以丙类为主，局部甲类。甲类生产区主要为提取车间、溶剂回收车间。建筑耐火等级为二级。 主要建（构）筑物参见表 3-5：建/构筑物一览表。 序号建筑物名称占地面积M2层数数量建筑面积M2结构类型备注1 发酵车间 3 3310 轻钢2 提取车间 2 18303 制剂与包装1 8834 生物有机肥1 9005 化验室 1 9806 循环水站 1 3497 空压站 1 1928 制冷站 1 1929 溶剂回收 1 99010 原料库 2 1911
