1、 原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到 JM109 或BL21 等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入 JM109 菌株中。一 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌 JM109 或 BL21 中大量表达（一） 制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于 700ul LB 培养基，加入 0.7ul Amp（100mg/mL） ，37 oC200r/min 摇床培养，过夜活化。2. 以 1：50 比例（200ul） ，将活化的过夜培养物加入 10mL LB 液体培养基中，加入 10uLAmp（100mg/ml） ，37
2、 oC200r/min 摇床扩大培养 2h-3h，期间取样监控菌液的 OD 值，控制菌液 OD600 在 0.6-1.0 之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般 3h 时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从 10ml 扩大培养物中取 3ml 菌液作为不加 IPTG 的空白对照（CK ） ，其余7ml 菌液加入 7ul IPTG（储存浓度为 0.5mol/l） ，使 IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。以 200r/min 的转速，37 oC 摇床培养 3h。4. 以 5000r/min 离心 2min 收集菌
3、体，倾倒上清，每个离心管收集 3ml 培养物。5. 加入 1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离心2min，倾倒上清。6. 重复步骤 5。将离心管中的水倒干净。（二）菌落 SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入 200ul 1SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少 loading buffer 的量，一般 200ul 比较合适 )。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于 100恒温加热器上开盖加热 10min（Marker 也要加热） 。样品凉后，12000r/min 离心 3min，取每管的上清点样。上
4、样量一般 30ul40ul，marker 20ul。（三） SDS-PAGE 分析1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶蛋白分子量 (kDa) 凝胶浓度 (%)4-40 2012-45 1510-70 1215-100 1025-200 8分离胶（两块）配方15% 12% 8%ddH2O 3.4ml 4.9ml 6.9ml30% Acr-Bis (29:1) 7.5ml 6.0ml 4.0ml1.5M Tris-HCl（ pH8.8） 3.8ml 3.8ml 3.8ml10%SDS 150ul 150ul 150ul10%过硫酸铵 150ul 150ul 150ulTEMED 20ul
5、 20ul 20ul总体积 15ml 15ml 15ml按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加7ml溶液。加完后， 用1mLddH 2O封住分离胶液面，在室温（37）凝结30min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。2.制作浓缩胶 浓缩胶（两块）配方5%ddH2O 3.4 mL30% Acr-Bis (29:1) 0.85 mL1M Tris-HCl（ pH6.8） 0.63 mL10%SDS 50 uL10%过硫酸铵 50 uLTEMED 20 uL总体积 5ml胶配好后混匀，灌胶 2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调
6、整梳子插入的深度，于室温(37)凝胶 30min。3.胶凝好后，拔梳子，将胶放入电泳槽中，加入 1Tris-Gly 电泳缓冲液没过点样孔，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极4.Marker 点 5uL，用 10uL 小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。电压打到 70V，保证电流在 20mA-30mA 之间，当样品跑入浓缩胶时可适当调高电压，但不宜多次调整电压，否则条带会跑歪。5.当溴酚蓝电泳至胶槽底部时,一般需要 2.5h，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min 染色 3h，可以过夜染色。6.用移液器回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，倒入考
7、马斯亮蓝脱色液，40r/min 脱色至胶背景透明，期间可每 2h 更换一次脱色夜。根据菌落 SDS-PAGE 的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。二 鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白1. 从冻存的菌液中取 10ul，接种于 5ml 的 LB 培养基中，加入 5ul Amp(100 mg/ml),过夜活化菌株。2. 按照 1：50 的比例，从活化的菌株中，取 1ml 菌液接种于 50ml LB 培养基中，加入 50ul Amp(100 mg/ml)，扩大培养 3 h。3. 扩大培养后的菌液,取出 10ml，不加 IPTG，作为空白对照。剩余的40ml 菌液中加入 40ul IPTG（0
8、.5mol/l）,诱导蛋白表达。两者在 37，200rpm 的条件下培养 3h。4. 用 50ml 离心管收集菌体，8000rpm，离心 3min。注意配平。5. 倒掉上清，加入 40ml 左右的 dH2O 洗菌体一遍，12000 rpm，离心2min。注意要将菌体充分打散。6. 倒掉上清，用枪头将上清吸干净。根据菌体的浓度，加入适量的 PBS buffer 悬浮菌体。7. 用大功率的超声波将菌体破碎，其间超声波每工作 2min，停止 1min。菌体要始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白不易变性。如此反复 6-10 遍，直至菌液清澈。8. 12000rpm， 离心 3min，分离上清和沉淀
9、。9. 在沉淀中加入 250ul 1SDS Loading buffer ,取 200ul 上清，加入 50 ul 5SDS Loading buffer，在恒温加热器上 100加热 10min。 10.加热后的样品冷却到室温后，12000rpm，离心 2min。11.取上清 40ul 点样，按照一中的方法进行 SDS-PAGE 检测。点样顺序是：对照的上清，沉淀，样品的上清，沉淀。12.根据 SDS-PAGE 结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生。如果蛋白在沉淀中大量表达，则形成包涵体，需要改变诱导表达条件，比如将扩大培养与诱导培养的温度改为 25，并延长相应培养时间。如果
10、蛋白在上清中表达，则形成可溶性蛋白，可继续进行下一步实验。三 纯化目的蛋白（整个过程要尽量保持在 4进行）1. 大量诱导目的蛋白（一般需要 2-4 L 的菌量） ，用超声波破碎细胞，收集上清。2. GST 纯化柱的柱床保存在 20%的乙醇中，使用之前，先用吸管将柱床轻轻加入到柱子中，打开柱子，流出乙醇，使柱床沉积下来。3. 加入 10ml PBS buffer,洗柱床 3 遍，使得柱床重新平衡。4. 将准备好的样品加入到柱子中，每次加入 5-10ml 样品，使样品结合在柱子上（每次上样量不能太多，因为柱子的结合能力有限） 。5. 用 PBS buffer 洗柱子 3 遍，每次用 10ml，去除
11、柱子中非特异性结合的杂蛋白。6. 加入 5ml 洗脱液（10m mol/l 的还原型谷胱甘肽，用 50mmol/l tris-bufferr 或者 PBS buffer 溶解）将目的蛋白洗脱出来。用 1.5ml 离心管收集流出来的样品，每管接 0.5ml 样，一共收集 6-8 管(一般情况，第一管流出的是 PBS，第二和第三管大部分是目的蛋白，所以 OD 值很大，第三至第六管的 OD 值慢慢降低。不要偷懒一次接太多，不然会影响后续收集蛋白。还原型谷胱甘肽很容易被氧化，如果一次没有用完，请用保鲜膜封口置于 4 度冰箱保存，超过 2 天的话请更换新的洗脱液。)7. 用 PBS buffer 洗柱子
12、 1 遍。8. 用分光光度计测每一管的 OD 值，记录下读数，将读数大于 200 的样品留下(一般是第 2 至第 4 管)，冻于-20冰箱中。9. 重复步骤 4-8，直至所有样品均纯化完毕。10.可以用 SDS-PAGE 检测纯化出来的样品浓度以及纯度。重生柱子的方法：（柱子使用三四次之后，需要重生，即让柱子上的 GST 结合基团重新暴露出来）1用还原型谷胱甘肽洗脱液洗柱子 3 遍，每次加入 10ml。2. 用 PBS 缓冲液洗柱子 4 遍，每次加入 10ml。3. 用 50 mmol Tris HCl（pH 8.0）洗柱子 3 遍，每次加入 10ml。4用 0.5M NaCl（pH 8.0）
13、洗柱子 3 遍，每次加入 10ml。5. 用 100 mM 醋酸钠（pH 4.5）洗柱子 3 遍，每次加入 10ml。6. 用 0.5M NaCL 洗柱子 3 遍，每次加入 10ml。柱子长时间不用，需要按照以下方式清洗及保存：1. 按照重生的 1-6 步骤先将柱子重生一遍。2. PBS 洗柱子 2 遍，每次加入 10ml。3. 将柱床用吸管吸出，分别用 5%，10%，15%，20%的乙醇洗 2 遍。4. 用单蒸水轻轻冲洗柱子底部的膜，洗出杂蛋白。5. 柱床保存在含 20%乙醇的 PA 瓶中。柱子和柱床置于 4 度冰箱保存。如果柱子用于纯化不同的蛋白， 只需要按照重生方法的 1，2 步骤操作即
14、可，然后直接纯化另外一个蛋白。如果柱子流速很慢，可能是柱子底部的膜被杂蛋白堵住了。柱子重生之后，将柱床用吸管吸出，然后用单蒸水将柱子底部的膜轻轻冲洗，再将柱床加入到柱子中，重新上样。如果柱子需要重生，请用完柱子的同学自觉完成这份工作，以免影响下一位同学的使用。四 根据不同的用途浓缩蛋白1. 若蛋白用于制作抗体如果洗脱液用的是 tris-bufferr 配制的，需要用 1/4 的 PBS buffer 进行透析，然后在冷冻干燥机中冻干浓缩，因为公司最终需要将目的蛋白溶于 PBS buffer 中。如果洗脱液是用 PBS buffer 配制的，则直接在冷冻干燥机中冻干浓缩。GST 纯化柱手册上建议的是用 tris-bufferr 配制洗脱液，但用 PBS buffer 配制的洗脱液可以将目的蛋白洗脱下来。可自己选用。2. 若蛋白用于活性检测由于蛋白在 tris-bufferr 和 PBS buffer 中，均能保持活性，所以不论用哪种，都不需要透析，直接浓缩干燥即可。
