常规病毒学实验技术.doc

1、常规病毒学实验技术（一）病毒的培养实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠主要用于： 分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 培养病毒，制造抗原和疫苗 测定各毒株之间的抗原关系， （用实验动物作中和试验和交叉保护实验） 制备免疫血清和单克隆抗体 作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。鸡胚（一）条件要求SPF 鸡、孵化温度 38-39，湿度 40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过 10 天并保存 10左右。（二）优点组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有

2、大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。（三）接种途径1 绒毛尿囊膜接种（10-12 日龄鸡胚）主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。1） 方法一（造人工气室） 在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约 3-4mm的烤焦圈。 用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 在气室端中央钻一个小孔。 用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 用 1ml 注射器滴入 2-3 滴接

3、种物于绒毛尿囊膜上。 用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。 鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。2）方法二 在气室端的卵壳上开约 1.51.5cm 的口。 用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 滴入接种物。 用透明胶纸封闭开口。2 尿囊腔接种（10-11 日龄）用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1） 画出气室和胚位2） 在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3） 用钢锥穿一小孔4） 将注射器针头沿此小孔插入 0.5-1cm，注入接种物5） 用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵 1-2 次3 卵黄囊接种（6-8 日龄）主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣

4、原体和立克次氏体等的分离和增殖。1） 画出气室和胚位2） 垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒气室外端3） 以钢锥在气室中央锥一小孔4） 将注射器针头沿此小孔插入 3cm，注入接种物5） 用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵 1-2 次4其它接种途径 羊膜腔接种，正粘病毒和副粘病毒静脉接种，蓝舌病毒脑内接种，狂犬病毒组织培养原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常即可使其贴附于玻璃壁上，并生长增殖。继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细

5、胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）1） 在无菌条件下采取 9-10 日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除去头（或仅除去喙和眼） 、爪和内脏，并剪成块。2） 用 Hanks 液，充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其它广口瓶中，用眼科剪剪成 1mm3大小的碎块。3） 加入 Hanks 液，充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液。如此反复冲洗 2-3 遍。4） 于沉淀组织块内加入约 4 倍量的 0.25%胰酶，并调整 pH 至 7.6-7.8，振荡混匀后置37水浴中感作 30 分钟，每 10 分钟轻轻摇动一次。5） 取出，小心吸弃上

6、层胰酶溶液，用洗液轻洗 2 次后，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。6） 用双层或三层纱布过滤，收集滤液于离心管中，以 600rpm 离心沉淀 5-10min，吸弃上清液，按每个鸡胚 5ml 的量，加入营养液，并用吸管反复吹打，直至形成均匀的细胞悬液。7） 细胞计数（培养时，使细胞达到 5105个/ml）取细胞悬液 0.5ml+2ml 0.1%结晶紫构椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或 37温箱中5-10 分钟，充分振荡后进行计数。按白细胞计数法计算 4 角 4 个大方格内的细胞总数（N） 。每 ml 悬液中的细胞数（n）=N/410000K（稀释倍数） 。传代细胞系培养优点：1)可以无限的

7、传代。2)不少细胞系对病毒很敏感。3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。细胞分散剂1 胰酶 使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。2 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）营养液1 人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。2 血清1） 动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子。2） 促进细胞的贴壁和生长。3）具有很强的酸碱缓冲作用。（二）病毒感染力的滴定LD50，EID 50，

8、TCID 50（TCID 50 的测定）1 在青霉素瓶中将病毒作连续 10 倍的稀释，从 10-1 10-10。2 将稀释好的病毒接种到 96 孔微量培养板中，每一稀释度作 8 孔，每孔接种 100ul。3然后在每孔加入细胞悬液 100ul，使细胞量达到 3105 个/ml。4设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。5逐日观察并纪录结果，一般需要观察 5-7 天。6结果的计算，按 Reed-Muench 两氏法或 Karber 法进行。TCID50的计算方法：1Reed-Muench 法病毒液稀释度出现CPE 孔 不出现 CPE 孔累计出现 CPE 孔 不出现 CPE 孔出 CPE 的孔 所占的

9、%10-1 8 0 27 0 100（27/27）10-2 8 0 19 0 100（19/19）10-3 11 1 91.6(11/12)10-4 4 6 40（4/10）10-5731157 1 13 0.7（1/13）10-6 0 8 0 21 0（0/21）高于 50%的百分数-50% 91.6-50距离比例= = =0.8高于 50%的百分数-低于 50%的百分数 91.6-40lgTCID50=距离此例 X 稀释度对数之间的差+高于 50%病变率的稀释度的对数=0.8(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.82. Karber 法病毒液稀释度 出现 CPE 孔的比率10

10、-1 8/8=110-2 8/8=110-3 7/8=0.87510-4 3/8=0.37510-5 1/8=0.12510-6 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L: 最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-（-1）(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml（三）病毒中和试验一、原理 抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。二、用途1. 疾病诊断。2. 病毒分离株的鉴定。3. 不同病毒株的抗原关系研究。4. 疫苗免疫原性的评价。5. 免疫血清的质量评价。6. 测定实验动物血清中是否存在抗体

11、等。三、分类（一）终点法中和试验1. 固定病毒稀释血清法。1) 将测好 TCID50 的病毒稀释成 200 个 TCID50 的病毒悬液。2) 在 96 孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释（具体方法是在 96 孔板中先加入 50ul 生长液，再加 50ul 待检血清，混匀后，吸 50ul 至下一孔，如此下去。一直到 1:256） ，每个稀释度作 4 孔。3) 在上述各孔内加入 50ul 稀释好的病毒液，混匀后放入 37 5%CO2 培养箱中作用45min-60min。4) 同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照。5) 感作完成后每孔加入 100ul 细胞悬液，放 37

12、 5%CO2 培养箱培养，逐日观察并记录结果。6) 结果计算，按 Reed-Muench 两氏法或 Karber 法进行。Reed-Muench 计算方法：血清稀释度 CPE 孔数无 CPE 孔数累 计 CPE 孔数 无 CPE 孔数 保护率（%）1:4（10 -0.6） 0 4 0 9 1001:16（10 -1.2） 1 3 1 5 831:64（10 -1.8） 2 2 3 2 401:256（10 -2.4） 4 0 7 0 01:1024（10 -3.0）4 0 11 0 0高于 50%的保护率-50% 距离比例= 高于 50%的保护率低于 50%的保护率83-50= = 0.783

13、-40高于 50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数=-1.2+0.77(-0.6)=-1.66 -1.66 的反对数=1/46即：1:46 稀释的待检血清可保护 50%的组织培养细胞免于出现 CPE。2. 固定血清稀释病毒法。1) 将病毒作连续 10 倍稀释1） 将稀释好的病毒接种 96 孔板，每个稀释度接种一纵排共 8 孔，每孔 50l，做两块板子，在一块板子的每孔加入 50l 待检血清（试验组） ，另一块板子的每孔加入 50l正常血清（对照组） ，混合后置 37 5%CO 2培养箱作用 1h。2） 然后在每孔中加入 100l 细胞。3） 另外还设两纵排正常细胞对照。4） 置

14、 37 5%CO 2培养箱培养，逐日观察并记录结果。5） 分别计算每组病毒的 TCID50，然后计算血清的中和指数。试验组 TCID50中和指数= 对照组 TCID50(二) 蚀斑（痘斑）减数试验1、蚀斑技术病毒蚀斑：又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：将病毒悬液作连续的 10 倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。用途：用于病毒纯化；测定病毒悬液中感染病毒的含量。2、蚀斑减数试验将病毒正常血清混合物以及病毒待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进

15、行蚀斑测定，比较病毒正常血清组和病毒待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比对照组减少 50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。(三) 交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检 V 的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。用途：（1）应用已知 V 鉴定未知 V （2）应用已知免疫血清鉴定未知 V（3）应用已知 V 鉴定未知血清（四）病毒的分离和鉴定病毒材料的注备1 脑、肝、肌肉等器官或组织充分研磨后加入 5 倍量的 Hanks 液（内含 P.S 各 200V/

16、ml）反复冻融三次。2000rpm 10min，取上清作接种物。2 鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物用内含青、链霉素 100u/ml 的 Hanks 液，将其稀释 3-5 倍，充分混匀悬浮后，置 4冰箱内感作 2-4h 或过夜，200rpm 10min 取上清作接种物。3 咽喉拭子或鼻拭子仔细用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速将其泡入盛有 2-5ml Hanks 液的（200-500u/ml P.S）试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融 3-5 次，收集液体部分，2000rpm 10min，收集上清作接种物。4 粪便用含 100u/ml P.S 的 Hanks 液作 10-20 倍稀释，4感作 4h，20

17、00rpm 10min 取上清作接种物。5 无菌的体液或鸡胚液直接接种用。接种方法1 实验动物2 鸡胚目前常用鸡胚分离的病毒有正粘 V、副粘 V、痘 V、脑炎 V 及引起禽类疫病的其它许多V。3 组织培养细胞。病毒增殖的判定1 细胞病变（CPE）2 抗原的测定3 中和试验4 病毒间的干扰现象乙型脑炎 V 脊髓灰质炎 V流感 V 西方马脑炎 V猪传染胃肠炎 牛病毒性膜炎 粘膜病 V5 电子显微镜观察6 实验动物或鸡胚接种病毒感染力的滴定LD50、EID 50、TCID 50病毒理化学特性的测定1 病毒核酸型鉴定（药物抑制试验）FUDR、IVDR、BRUDR原理：FUDR、ICDR、BRUDR 是

18、嘧啶的卤化物，进入 cell 后发生磷酸化，掺入新合成的 DNA以代替胸腺嘧啶产生至功能分子，从而抑制 DNA 的合成。常用浓度为 50ug/ml。2脂溶剂敏感性试验1） 乙醚敏感试验取同批病毒分装于两个青霉素瓶中，每瓶 16ml，在其中 1 瓶加入麻醉用乙醚，使终浓度为 20%，两瓶均用橡皮塞塞紧后，置 4冻箱内作用 24h，其间不时振荡，随后以2000rpm 离心 20min。已加乙醚的小瓶，用毛细吸管吸取病毒液，移入另一小瓶内，适当吹打，使残余乙醚挥发殆尽，然后滴定两组病毒的 TCID50。2） 氯仿敏感性试验向病毒液内加入分析纯氯仿，使其终浓度为 4.8%，置 4振荡混合 10min。

19、随后500rpm 5min，然后吸取上层液体，滴定病毒 TCID50。对照组病毒加入终浓度为 4.8%的生理盐水，同样处理和滴定。3胰蛋白酶敏感试验脊髓灰质炎 V、猪传染性胃肠炎 V 对胰酶有较强的抵抗力，痘 V、呼肠孤 V、疱疹 V 易被胰酶灭活。取病毒液两瓶，每瓶 1ml,在其中 1 瓶加入 1ml 1%的 trypsin，使终浓度为0.5%，另一瓶加入 1ml 1640（培养基） ，用橡皮塞塞紧瓶口，将小瓶倒转几次，使其充分混合，置 371h，随即加入灭活犊牛血清 8ml，充分混合，终止胰酶的作用。最后滴定两瓶 V 的 TCID50。4 耐酸性试验pH3.0 2h or pH5.0 1h

20、取等量病毒液两瓶，用 0.1mol/L HCL 将 1 个小瓶中的病毒液的 pH 调至 3.0(or 5.0)，并在另一个小瓶内加入相同于用酸量的培养基作为对照，置 37水溶或室温中感作 2h(or 1h)，再用 5.6%NaHCO3溶液将 pH 调回至 7.2 左右，对照组再加紧入相同于 NaHCO3量的培养基，测定两者的 TCID50。5 耐热性试验将病毒液分成等量的 11 小瓶，其中 4 小瓶分别置 50、60、70、80水溶中1h，另 6 瓶置 50水浴中分别感作 5、10、15、30、60 和 180min，随后测定每瓶 V 的感染X。6 病毒粒子大小测定1)电子显微镜直接观察（透射

21、电镜、磷钨酸负染）2)超速离心沉淀3)滤过试验取澄清的病毒液 20ml，留出 1ml 作为对照，将剩余的 19ml 病毒液在正压下依次通过孔经为 450nm、225nm、100nm 和 50nm 的各级微孔，每通过一种孔径的滤膜就吸取 1ml 滤液用为样品，并将剩余的滤液通过一次滤膜。最后测定原病毒液以及各级滤液的 TCID50。病毒液种类 TCID 50/0.1ml滤前病毒液 10 -6.75450nm 孔径液 10 -6.23225nm 孔径液 10 -5.78100nm 孔径液 10 -4.5050nm 孔径液 10 -0.50免疫血清学检查目的：新分离毒株的种类及型别的鉴定。检测发病动

22、物体液中的 Ab，或进一步比较动物急性发病期和恢复期血清中的 Ab效价，了解病毒性 Ab 是否有明显的增长，从而判定 V 感染的存在。（一） 中和试验1 终点法中和试验固定病毒稀释血清法中和试验固定血清稀释病毒法中和试验2 蚀斑（痘斑）减数试验1） 蚀斑技术病毒蚀斑，又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：将病毒悬液作连续的 10 倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每毫升所含的蚀斑单位。用途：用于病毒纯化；测定病毒悬液中感染病毒的含量。2） 蚀斑减数试验将病毒正常血清混合物以及病毒待检血清混合物分

23、别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒正常血清组和病毒待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比对照组减少 50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。3 交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检 V 的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。用途：（1）应用已知 V 鉴定未知 V；（2）应用已知免疫血清鉴定未知 V；（3）应用已知 V 鉴定未知血清。（五） 凝集试验定义：颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）或表面载有抗原的颗粒状的物质（如

24、聚苯乙烯胶乳、红细胞、炭素颗粒等） ，与相应抗体在电解质存在下凝集成团的试验。分类直接凝集试验：颗粒状 Ag 与相应 Ab 所发生的凝集反应。 （布氏杆菌）间接凝集试验（被动凝集试验）：可溶性抗原吸附到载体颗粒表面，与相应抗体所发生的凝集反应，可以证明相应抗体的存在并测定效价。反相问接凝集试验（反向被动凝集试验）：将抗体吸附到颗粒表面与相应抗原所发生的凝集反应。间接血凝试验胶乳凝集试验炭凝集试验 间接凝集试验皂土凝集试验脂质体凝集试验间接凝集抑制试验：先将被检的抗体（或抗原）与已知的抗原（或抗体）作用后，再与抗体（或抗原）致敏的颗粒时行反应。反向凝集抑制试验间接凝集试验的优点：快速、简便、特异

25、、敏感间接血凝试验（IHA） （PHA）口蹄疫、猪瘟、弓形体、胸膜肺炎、衣原体反向 IHA：FMDV、水疱病病毒 Ag、猪传染笥胃肠炎病毒 Ag、小鹅瘟病毒 Ag 等。红细胞作为载体的优点：1 来源广泛，容易取得。2红细胞表面几乎可以吸附任何一类的 Ag 或 Ab，如蛋白质、糖蛋白、核蛋白以及多糖等。3具有天然的均一性，比其它许多载体都更容易标准化和规格化。缺点：容易破裂、难于保存IHA 的优点：敏感性高、特异性强、重复性和稳定性好，操作简便、反应迅速。既可定性又可半定量，而且试剂价格低廉，不需要特殊、复杂的设备。注意：影响红细胞凝集的因素很多：红细胞的来源，致敏条件、操作技术、标本中的杂质、

26、细菌污染和类属 Ag 常引起非特异性凝集反应。1 红细胞的选择和保存选择：许多种类动物的红细胞，包括人的 0 型红细胞都可用，但用得最多的是绵羊红细胞。保存：用玻璃珠脱纤法采集或用肝素抗凝。无菌的红细胞在 4冰箱中可保存 3-4 天。采血时加等量氏液和适量抗生素，4保存 2 周，但这样红细胞致敏时容液自凝。2 红细胞的醛化醛化剂：甲醛、戊二醛、丙酮醛、丙酮醛甲醛双固定、戊二醛丙酮醛双固定。1） 无菌采取绵羊静脉血，加至红细胞保存液内，4保存备用。2） 取红细胞悬液 1 份，加入 10 倍量 0.1mol/L、PH7.2 磷酸缓冲液（PH7.2PB） ，洗 5 遍，并以该液配成 8%红细腻悬液。

27、3） 红细胞悬液 1 份+3%丙酮醛液等量，24 左右的室温中用电磁搅拌器缓慢搅拌17h。PH7.2PB 配成 8%悬液，丙酮醛固定红细胞悬液。4） 丙酮醛固定红细胞悬液 1 份+等量 3%甲醛液，如上搅拌 17hr。5） 再以 PH7.2PB 液洗 5 遍，最后用内含 0.1%叠氮钠的 ph7.2PB 配成 20%的红细胞悬液，分装后置 4冰箱内保存，可用 2 个月双醛化红细胞悬液。3红细胞的鞣化作用： 可增加红细胞吸附蛋白质的能力，新鲜红细胞用 1：200000 浓度的鞣酸，醛化红细胞用 1：100000 浓度的鞣酸。程序： 取红细胞，用 PH7.2PB 洗 45 遍，并用同液配成 2.5

28、%悬液，同时以 PH7.2PB 临时配制 1：200000 优质鞣酸，将其与红细胞悬液等量混合，37水浴咸作 15min。取出后用 ph7.2PB 洗一次，再用 PH7.2pB 配成 20%红细胞悬液。4致敏红细胞的制备：1） 抗体致敏红细胞取 20%鞣化或未鞣化的双醛化红细胞悬液 1ml，离心沉淀，弃去上清液，将沉淀红细胞重新悬浮于 0.1mol/L.PH3.54.0 醋酸缓冲液 10ml 中，加入等量的提纯 IgG 液（每毫升需含 IgG100300g）置 37水浴中咸作 2-4h，每 15-20 分钏用吸管轻轻吹吸混合 2-3 次。以 ph7.2PB 洗 5 遍，再将沉淀红细胞用 1%灭

29、活免血清盐水配成 0.8%悬液备用。 Ab 致敏红细胞悬液。2） 抗原致敏红细胞取 PBS（PH6.4）4ml 病毒抗原 1ml，2.5%鞣酸化红细胞悬液 1ml，混匀后，置室温下振荡结合 3060min（随病毒 Ag 种类不同）或 37水浴 30-45min，其间适当振摇。随后以 1500rpm 离心沉淀 10min，并用 2 倍量的 PH7.2PB(内含 1%灭活兔血清)洗 2 遍后，配成 1%的致敏红细胞悬液供试验用。以病毒致敏的红细胞悬液应立即使用。4冰箱保存，不宜超过2 天。致敏红细胞的保存：用 1%兔血清盐水或 0.4%明胶缓冲液洗涤，并用其配成 2.5%悬液保存备用。长期保存：用

30、含 1%糖和 4%兔血清的生理盐水，将致敏红细胞配成 10%悬液，然后于真空中冷冻干燥。乳胶凝集试验乳胶的预处理取空白乳胶用 PBS（PH7.4）配成 2%溶液，加入 10%的胰蛋白酶液，使其终浓度为1%，于 56水溶作用 18-24h，其间摇动几次，置 4冰箱保存备用使乳胶稳定并减少非特异性凝集。 （离心上清，将沉淀用 PBS 悬浮配成 2%乳胶溶液）乳胶的致敏1 将浓缩的病毒抗原作倍比稀释（PBS） ，加入等量的 2%空白乳胶中（逐滴加入，边加边摇动） 。37作用 15-30min。2 加入 10%牛血清白蛋白，使终浓度为 1%，混合均匀，37 15-30nin，或 2h，即得乳胶抗原。（

31、六）标记抗体技术（免疫标记技术）原理： 抗体能追踪抗原，在抗原所在部位与之结合，一旦结合后就不易洗脱。但此种结合反应肉眼不易察出。有一些物质在超微量时，即能用某种特殊理化因素将其检测出来。如将这些构标记在抗原或抗体分子上，就能利用调换体与原特异结合的特性，检测抗原或抗体，即免疫标记技术。荧光抗体技术（免疫荧光技术）分类： 酶标记抗体技术（免疫酶技术）同位素标记抗体技术（放射免疫测定技术）铁蛋白标记抗体技术免疫荧光技术基本方法和原理1 直接法将标记的特异荧光抗体，直接加在 Ag 标本上，经一定温度和时间的染色，用水洗去来参加反应的多余荧光抗体，室温干燥后封片，镜检。优点：方法简便，非特异荧光染色

32、因素少。缺点：不够敏感，且一种标记抗体只能检测一种 Ag。2 间接法既可检查抗体，也可检查抗原。1） 检查抗原用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗体（二抗）与抗原标本反应，使之形成抗原一抗体抗抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗抗体，干燥封片后镜检。2） 检查 AbAb 标本为已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤同上。缺点：但特异性较差。可能是间接法的中间层可结合更多的标记抗体所致。优点：敏感性高，且标记一种抗体球蛋白抗体，可用于多种抗原，抗体系统的检查。既可检测 Ag，也可检测 Ab。3 补体法应用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴

33、定未知 Ag 或未知 Ab。先将未标记的 Ab 和补体加在 Ag 标本上，使其发生反应，随后再加标记抗体抗体，使之形成Ag Abcb 抗补体复合物。缺点：特异性较差。优点：敏感性高。标记一种抗体补体Ab，可用于各种 AgAb 系统的检查（可用于各种动物）间接法：双层法、混合法、三层法。补体法：抗体一抗补体法、异属补体结合法。涂片压印片、冰冻切片、石蜡切片、组织培养物、可溶性 Ag 标本（醋酸评维素膜） 。放射免疫测定技术原理： 用放射性同位素标记已知的 Ab 或 Ag，用以检测被检材料中 Ag 或 Ab。随后根据AgAb 复合物中的同位素放射性强度进行定性或定量的测定。优点：敏感性和特异性都很

34、强。缺点：射线污染。分类和操作原理：（一） 液相放射免疫测定1 直接法（Ag、Ab）用放射性同位素标记病毒 Ag 或 Ab。检测相应的 Ab 或 Ag。主要同于颗粒性物质，如悬浮细胞内病毒抗原的初步检测，检测 Ag 时，通过超速离心将 AgAb 复合物沉淀下来，分别检测沉淀物和上清液中的放射性强度，检测 Ab 时，在 Ab、Ag 感作以后，再加入适当浓度（40-50%饱和度）的硫酸铵，叫 AgAb 复合物盐析沉淀，而 Ag 仍处于溶解状态。2 间接法（主要用于病毒抗体的检测）被检血清+ Ag+二抗离心沉淀 3 竞争法（主要用于病毒抗原的检测）被检抗原+标定浓度的特异抗体，混合咸作一定时间再加入

35、标定量的放射性同位素标记抗原离心沉淀。（二） 固相放射免疫测定（聚苯乙烯小管或微量滴定板上，或者用溴化氢、二醛等将 Ab偶联或共价联结于琼脂糖珠或纤维素等表面）1 夹心法Ab+待检 Ag+标记 Ab2 夹心间接法，与上法相比，敏感性更强。Ab 包被+待检 Ag+另一动物的抗病毒 Ab+同位素标记的抗第二次 Ab 的抗抗体3 竞争法Ab 包被+待检抗原+标记 Ag两者同时加入 or 待检 Ag 先加4 阻断试验法Ab 包被+已知 Ag+被检血清+同位素标记的 Ab。（三） 放射免疫自显影用同位素标记 Ab or Ag，然后进行琼脂扩散试验或免疫电泳对流免疫电脉，检测相应的 Ag or Ab。扩散

36、或电泳完毕后，将琼脂板置于盐水和 ddH2O 中充分浸泡，除去未结合的标记 Ab 或 Ag。干燥后，覆盖 X 光胶片，置暗室中曝光 1-2 天。经过显影和定影，即可在X 光胶片上显示特异的沉淀线。免疫酶技术免疫酶染色法抗酶抗体法放大抗体法：同时使用酶标记抗体和抗酶抗体1 酶标记抗体法1） 直接法用酶标记的特异性 Ab，直接检测病毒或病毒 Ag。在将含有 uirus 或 virus Ag 的组织和细胞标本固定的消除其中的内源性酶以后，应用酶标记 Ab 直接处理，随后滴加底物显色，直接镜检。2） 间接法将含有 V 或 V Ag 的组织或细胞标本，先用特异性 V Ab 处理，充分涮洗后，再用酶标记的

37、抗体处理，使其形成 Ag-Ab-酶标记抗体复合物，最后滴加底物，镜检。2 抗酶抗体法不需进行酶的标记，比前都简便和灵敏1） 免疫球蛋白桥法搭桥：用二抗（如抗兔 IgG 的抗体）将抗体和已结合在病毒抗原上的同种动物（兔）特异性 Ab 连接起来。加酶，形成 Ag+Ab+抗抗体+抗酶抗体+酶加底物显色、镜检。2） 可溶性酶抗酶复合物法（PAP）3） 杂交抗体法将来自同种动物的抗 IgG 抗体（或其 Fab 碎片）与抗酶抗体（或其 Fab 碎片）结合起来，使之成为一种具有抗 IgG 和抗酶双重活性的杂交抗体。再用这种杂交抗体进行免疫酶染色。Ag+Ab+杂交 Ab+酶（一） 免疫酶测定法固相免疫酶测定法

38、：利用固相载体，以化学的或物理的方法将 Ag 或 Ab 联接于其上，制成免疫吸附剂，随后进行免疫酶测定。均相免疫酶测定法：不需将游离的和结合的酶标记物分离，也不需要载体，直接从溶液中测定结果。1 固相免疫酶测定法根据固相载体的种类和免疫吸附剂的制备方法。分为两类：、1） 酶联免疫吸附试验或测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA） 。 间接法，用 Ag 包被板子+Ab（未知）+抗 Ab+酶底物显色 双抗体夹心法，用于检测 Ag。Ag+Ag（未知）+抗 Ab+酶底物显色 竞争法：（测定 Ag）利用酶标记 Ag 和未标记 Ag 共同竞争有限量的 Ab

39、，测定样品中的 Ag。需同时微只加酶标记 Ag 的系统作对照。Ab+待检 Ag 和酶标记 Ag（与可先加待检样品，稍后再加酶标记Ag） 。对照组：只加酶标记 Ag。 夹心间接法应用酶标记抗抗体测定 Ag。Ab+Ag（待检）+不同种动物的同的 Ab+酶标抗第二种抗体的动物球蛋白（二抗）2） 特定 Ag 基质球法（Defined antigen substrate sphere, DASS）应用溴化氰活化的琼脂糖球作为固相载体，将 Ag 或 Ab 结合于其上，制成免疫吸附剂。2均相酶免疫试验（酶放大免疫试验）利用竞争原理，将含有小分子半 Ag 的样品，酶标半 Ag 及相应 Ab 混合感作，随后测定

40、酶的活性。如果样品中主要用于激素、抗菌素和吗啡微生物等小分子半 Ag 的检测，没有半 Ag，则酶标半 Ag 与 Ab 结合，酶的活性受到抑制。ELISA 的操作要领：1 固相载体的选择聚苯乙烯微量反应板PVC 塑料软板硝酸纤维素膜，斑点ELISA（DotELISA）疏水聚酯布，布ELISA（C-ELISA）2 预备试验确定酶结合物、包被抗原或抗体的最适浓度，底物的最适反应时间。1） 酶结合物的确定用 PH9.6 的碳的酸盐缓冲液将 IgG 稀释至 100ug/ml,加入固相载体的每一孔中进行包被,洗涤后将酶结合物以 1:200,1:400,1:800作系列稀释,依次加入各孔,每一稀释度加2 孔

41、。反应完毕后加底物显色，以能产生光吸收值（A）为 1.0 的稀释度为结合物的最适浓度。2） 包被蛋白质浓度的确定将欲包被的蛋白质用 PH9.6 的碳酸盐缓冲液作 1：10，1：20，1：40.系列稀释，每一稀释度包被 2 个孔，然后进行常规的 ELISA 操作。以能产生光吸收值（A）为 1.0 的稀释度为包被蛋白质的最适浓度。3） 底物最适作用时间的测定以最适稀释度 Ag 和酶结合物进行试验，加入底物后在不同时向终止反应，即可确定最适反应时间。3 包被1） 载体2） 包被液的 PH：通常用 PH9.59.6,0.05mol.L or 0.1mol/L 的碳酸盐缓冲液稀释 Ag or Ab。吸咐

42、时的 PH 一般为 9.0 左右。如 PH 较低，则吸附时间延长，但 PH 低于 6.0 则非特异性吸附增加。3） 吸附时间与温度，一般为 4过夜，有时也可采用 37吸附 1-5h。4） 蛋白质浓度，在固相载体上，每孔加入量一般为 0.1-100us/ml。浓度太高，令固 Ag或 Ab 蛋白分子之间的相互作用较大而影响载体对蛋白质的吸附，浓度太低，则感染性下降。4 洗涤，将载体各也甩干，再加洗涤充满各孔，静置 3-7min 如此重复 3 次。常用的洗涤液： 含有 0.05%吐温-20，0.01mol/L PH7.4 的 PBS 或含有 0.05%吐温-20，0.01mol/L PH7.4 的

43、Tris-cl。5 封闭抗原或抗体包被后，载体表面仍可能遗留有未吸附蛋白质的空白位点，从而造成下一步的非特异性吸附。封闭液： 1%-3%牛血清白蛋白，3%-5%脱脂乳，10%牛或马血清加入封闭液后，37吸附 2h，然后洗涤。6 结果判定1） 目视比色法：定性2） 光电比色法：P/N 比法，P/N 值2.0 为阳性（七）聚合酶链反应（PCR）与疾病诊断聚合酶链反应（ polymerase chain reaction, PCR）是 1985 年 Mallis 等根据核酸自然扩增的原理，建立的一种人工体外扩增 DNA 技术，目前已广泛应用于病毒学研究及病毒病的诊断。基本原理PCR 又称为体外酶促基

44、因扩增，即在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核糖核苷酸（dNTP ）存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的体外扩增反应，其原理类似于天然 DNA 的复制。双链靶 DNA 分子变性后解链，两条单链 DNA 分别经复性与两条引物互补结合，在4 种 dNTP 存在和合适的条件下，由 DNA 聚合酶催化引物由 53 扩增延长，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板 DNA 增加 1 倍，新合成的 DNA 链又可作为下一循环的模板，经过 30-50 个循环，可使原 DNA 量增加 106-109 倍。由于引物的序列决定了扩增的范围，而数十个循环，又使原 DNA 模板大量增加，因此，PCR 具有特异、敏感等许

45、多优点，适用于病毒性疾病的诊断。主要步骤PCR 的每一个循环包括变性、复性、延伸 3 个步骤。1）变性 通过加热（90-95） ，使双链 DNA 模板的氢键断裂，双链解离成单链。2）复性 适当降温（42-62） ，使引物与其互补的模板在局部形成杂交 DNA 双链。3）延伸 72，在 DNA 聚合酶、4 种脱氧核糖核苷酸底物及 Mg+离子存在的条件下，引物延长，新链合成。几种模板的处理方法1. 细菌挑细菌于离心管中，加适量 ddH2O，涡悬，于沸水浴中变性 10min，迅速置冰浴中，然后 3000rpm 离心数秒，取上清作为模板。2. 细胞培养物收集病变的细胞（不要冻融）悬液，10000rpm

46、离心数秒，取细胞沉淀用适量 Sample Buffer 悬浮，加入蛋白酶 K 至终浓度为 100g/ml，于 37温箱中作用 1h，取出于沸水浴中变性 10min,立即置冰浴中，3000rpm 离心数秒,取上清作为模板。Sample Buffer终浓度KCl 50mMTris-HCl(pH9.0) 10mMMgCl2 1.5mM明胶 0.01%Triton X-100 0.1%NP-40 0.45%Tween 20 0.45%3. 质粒、病毒基因组 DNA 沸水浴中变性 10min，迅速置冰浴上备用。4. 病料与鼻拭子1) 用匀浆器将病料组织充分匀浆，用 TEN 缓冲液按 1:5 进行稀释。2) 收集悬液于离心管内，-20 反复冻融三次。3) 取出，5000rpm 离心 5min。4) 取 472.5l 上清液于另一离心管中，加入 25l 10%的 SDS(终浓度为 0.5%)和 2.5l 20mg/ml 的蛋白酶 K(终浓度为 100g/ml)，混匀。5) 50水浴过夜6) 用等体积(500l)的苯酚:异戊醇、苯酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次7) 吸取上清，加 2 倍体积的无水乙醇、0.1 倍体积的 3M NaAc 于20沉淀 30min，10000rpm 离心 10min。8) 沉淀用 70%乙醇洗一次，真空抽干，用 20l ddH 2O 溶解，20保存备用。