1、高通量测序技术,2017年3月21号,主要内容,一、高通量测序简介二、 Solexa和Semiconductor测序原理三、高通量测序部分应用,高通量测序（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序（“Next-generation”sequencing），可一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序；可以对一个物种的基因组和转录组进行深入、细致和全貌的分析，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。,一、高通量测序简介,高通量测序的发展,1992年Lynx Therapeutics MPSS 2003年Polony Sequencing(哈佛）
2、2005年454 Pyrosequencing 2006年Solexa Sequencing-By-Synthesis 2007年ABI SOLID 2008年Helicos tSMS Sequencing 2009年Ion Torrent Semiconductor Sequencing 2011年Picfic Biosciences SMRT Sequencing,高通量测序的主要代表平台有:罗氏的(Roche)的454测序仪（Roche GS FLX sequencer）; Illumina的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）; ABI的SOLi
3、D测序仪（ABI SOLiD sequencer）; Thermo Fisher的离子半导体测序仪（Ion Semiconductor sequencer).,Illumina solexa,文库制备,二、Solexa和Semiconductor测序原理,Flowcell,簇生成，模板变性,OH,桥式扩增,diol,diol,1st cycle denaturation,clusters,并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终止技术（Reversible Terminator Chemistry）,信号收集,读取碱基序列,在测序过程中，每种碱基
4、被激发后都会发出特殊波长的荧光在每个循环过程中每一个簇只对应一张图像,NextSeq 500,MiSeq,Illumina 测序平台展示,Hiseq 4000,HiSeq X Ten,NovaSeq 6000,所有产出和read数量规格都基于单个流动槽计算，NovaSeq 6000系统可同时运行1个或2个流动槽。 b. N/A: 不适用。,Ion Semiconductor,测序流程,PCR产物纯化,文库制备,接头连接,片段筛选,样本混池,克隆扩增,不理想的扩增情况,ISP富集（Ion Sphere Partical Enrichment）,扩增引物的5端标记了生物素,通过链霉亲和素标记的磁珠
5、与标记了生物素的DNA结合.,测序,自然情况下，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中就会释放出一个H+，导致局部可检验的PH值发生变化，被离子传感器检测到，从而转换为数字信号。,碱基识别,依次掺入4中碱基连续两个相同碱基结合,Ion Torrent PGM,Ion Torrent仪器展示,三、高通量测序部分应用,全基因组测序,全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel）、结构变异位点（SV）位点和拷贝数变异位点（CNV)。 全基因组de novo测序是指对未知基因组序列的物种进行从头测
6、序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。,基因组测序策略,外显子组测序,外显子组 一个物种基因组中全部外显子区域的总和； 人外显子组只占基因组的1%，约30 Mb； 约85%的人类致病突变都位于这1%的蛋白质编码序列上。,文库构建,Nimblegen、 Agilent Illumina,mRNA测序(mRNA seq)是指利用高通量测序技术对cDNA进行测序从而得到一个样品中基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。,mRNA测序,文库构建,扩增,文库,通过带oligoT的磁珠分离出mRNA,LncR
7、NA是一类长度超过200nt的长链非编码RNA，通过与DNA、RNA或蛋白质结合，在表观遗传、转录及转录后等水平调控基因表达。 lncRNA测序是研究已有参考基因组物种的特定组织或细胞在某个特定时期转录出的所有lncRNA和mRNA。,LncRNA（long noncoding RNA)测序,文库构建,Small RNA 是长度约20-30nt的非编码RNA分子，主要包括miRNA、siRNA、piRNA等，是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。,Small RNA测序,文库构建,Circ RNA是mRNA在剪接的过程中，上游exon的5端与下游exon的3端剪接到一起，从而形成的首尾相接的环状RNA分子。 近年的研究表明，circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。 通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。,Circular RNA测序,文库构建,存在问题,测序速度及通量提高了，但是后续海量的数据分析却成为一大难题； 不适合小规模测序； 新一代测序仪价格昂贵。,谢谢！&问题？,
