1、生物信息学,谢文海 讲师 13371585745 ,第五章 蛋白质序列分析及结构预测,一、蛋白质的结构 二、蛋白质数据库介绍 三、蛋白质序列分析 四、蛋白质结构预测 五、蛋白质功能预测,从多条免疫球蛋白序列中提取的8个片段的多重比对,回顾,human beta globin （人珠蛋白） horse beta globin （马珠蛋白） human alpha globin （人珠蛋白） horse alpha globin （马珠蛋白） cyanohaemoglobin （蓝血红蛋白）whale myoglobin （鲸肌红蛋白） Leghaemoglobin （豆血红蛋白）,通过珠蛋白的比
2、较构建系统发育树判断生物进化分歧时间,回顾,结构是蛋白行使功能的前提,一、蛋白质的结构,蛋白质的结构主要分为四级, 一级结构、二级结构、三级结构以及四级结构。 一级结构:蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序,MTYKLILNGKTKGETTTEAVDAATAEKVFQYANDNGVDGEWTYTE,蛋白质二级结构,二级结构：主要由氢键维系的结构（-螺旋、-折叠）指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。 螺旋、 折叠、 转角、无规卷曲 、螺旋组合（）折叠组合（）和螺旋折叠组合（）,螺旋(helix)的结构特征为：,（1）主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋； （2）螺旋每上升一
3、圈是3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm； （3）相邻螺旋圈之间形成许多氢键； （4）侧链基团位于螺旋的外侧。 Ala、Glu、Leu、Met 促进形成 Pro、 Gly、Tyr、Ser不利于形成,人细胞珠蛋白(2DC3.pdb)的第121到140位残基 对应的a-螺旋侧面和顶部(N端)视图,（1）若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片； （2）所有肽键的C=O和NH形成链间氢键； （3）侧链基团分别交替位于片层的上、下方。,折叠(sheets) 的结构特征为：,反平行和平行的多个折叠链形成一个完整折叠结构的氢键示意图； 来自人pi型谷胱甘肽-S-转硫酶中单个亚基中连续主链的部分折叠结构(2D
4、GQ.pdb)侧面视图，可见转角(turn)； 来自人pi型谷胱甘肽-S-转硫酶一个亚基中连续主链的部分折叠结构顶部视图，可见转角(turn)； 来自人信号传递蛋白SMAD4(1DD1.pdb)的一个亚基中部分折叠结构顶部视图，可见到大的环区(loop)。,多肽链180回折部分，通常由四个氨基酸残基构成，借1. 4残基之间形成的氢键维系。 Asp、Asn、Ser、Thr、Gln 、Pro 常出现在转角,转角的结构特征为：,来自人细胞珠蛋白(2DC3.pdb)的两段螺旋由转角连接，用粗树枝状显示了两段螺旋末端的脯氨酸。,无规卷曲的结构特征为：,无规卷曲的特点为在主链骨架上无规则盘绕，其构象状态仍
5、遵循物理化学原理，但波动性较大，对温度变化敏感；实验测定三级结构时往往无法识别无规卷曲(缺失其座标)，即使有座标则其温度因子也较高。无规卷曲同环的区分主要是其长度和其形状的波动性。,超二级结构的主要类型和特征超二级结构(supersecondary structure)指位于同一主链的多个二级结构组装形成的特定组装体，可直接作为三级结构的或结构域的组成单元，是从蛋白质二级结构形成三级结构的一个过渡结构形式，也称为立体结构形成的模体。,（1）转角或环等连接连续四个螺旋形成的四螺旋捆； （2）中部固定位置含有亮氨酸及其他疏水侧链氨基酸残基、在螺旋两端含有强亲水侧链氨基酸的螺旋组成的亮氨酸拉链(Le
6、ucine zipper)； （3）一条主链中相邻七个两亲螺旋通过过度结构形成的七次穿膜螺旋组； （4）连续主链中两段螺旋连接三段折叠链形成的Rossmann折叠； （5）转角连接a螺旋构成的a-螺旋-转角-螺旋； （6）环连接螺旋构成的螺旋-环-螺旋等。 （7）-折叠都为超二级结构。,超二级结构的主要类型：,蛋白质三级结构,二级结构进一步折叠形成的结构域,三级结构:蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构，称为蛋白质的三级结构（tertiary structure）。蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键，包括氢键、疏水键、盐键以及范德华力（Van de
7、r Wasls力）等。,四级结构:具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构称为蛋白质的四级结构（quarternary structure）。其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基（subunit）。,蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级、四级结构,1. 蛋白质序列数据库：如PIR、SWISS-PROT、NCBI , 这些数据库的数据主要以蛋白质的序列为主, 并赋予相应的注释; 2. 蛋白质模体及结构域数据库：如PROSITE、Pfam, 这些数据库主要收集了蛋白质的保守结构域和功能域的特征序列; 3. 蛋白质结构数据库： 如
8、PDB 等, 这些数据库主要以蛋白质的结构测量数据为主; 4. 蛋白质分类数据库：如SCOP、CATH、FSSP 等, 这其中有以序列比较为基础的序列分类数据库以及以结构比较为基础的结构分类数据库之分。,依据蛋白质的结构层次, 将蛋白质数据库分为:,二、蛋白质数据库,蛋白质数据库特征:这些数据库种类有差别, 但内部是相互联系的.每个数据库都有指针指向其他数据库, 而且数据库之间的序列以及相应的结构是共享的, 同一种蛋白质依次会出现在不同的数据库. 这样的数据沟通有助于更深层地挖掘蛋白质的内在生物信息, 这些数据库是融序列信息的索取、处理、存储、输出于一身的。,1. 蛋白质序列数据库,（1）PI
9、R(protein information resource, PIR)和PSD (protein sequence database, PSD) http:/pir.georgetown.edu/pirwww PIR-PSD 是一个综合全面的、非冗余的、专业注释的、分类完整的蛋白质序列数据库。PIR-PSD 的序列来自于将GenBank/ EMBL/ DDBJ 三大数据库的编码序列的翻译而成的蛋白质序列、发表的文献中的序列和用户直接提交的序列。 （2）SWISS-PROT/ TrEMBL数据库 www.expasy.org/swissprot,数据库由蛋白质序列条目构成, 每个条目包含蛋白质
10、序列、引用文献信息、分类学信息、注释等, 注释中包括蛋白质的功能、转录后修饰位点、特殊位点和区域、二级结构、四级结构、与其他序列的相似性、序列残缺与疾病的关系、序列变异体等信息。,2. 模体以及结构域数据库,模体数据库 （1）PROSITE 蛋白质家族及结构域数据库( www.expasy.org/prosite/ )PROSITE 数据库收集了有显著生物学意义的蛋白质位点序列、蛋白质特征序列谱库以及序列模型, 并能依据这些特征属性快速可靠地鉴定出一个未知功能蛋白质序列属于哪个蛋白质家族, 即使在蛋白质序列相似性很低的情况下, 也可以通过搜索隐含的功能结构模体(motif)来鉴定, 因此是有效
11、的序列分析数据库。PROSITE 中涉及的序列模式包括酶的催化位点、配体结合位点、金属离子结合位点、二硫键、小分子或者蛋白质结合区域等, 此外PROSITE 还包括由多序列比对构建的序列表谱( profile) , 能更敏感地发现序列中的信息。,PROSITE同时数据库提供了序列分析工具: ScanProsite 是用于搜索所提交的序列数据是否包含 PROSITE 数据库中的序列模式或者SWISS-PROT 数据库中已提交的序列模式; MotifScan 用于查找未知序列中所有可能的已知结构组件, 数据库包括PROSITE序列表谱、PROSITE 模式、Pfam 收集的隐马尔可夫模式( HMM
12、)。,(2) PRINTS Fingerprint Database www.bioinf.man.ac.uk/dbrowser/PRINTS/ 这个数据库包含1 500 个蛋白质指纹图谱, 编码9 136 个单一模体。(3) BLOCKS ( www.blocks.fhcrc.org/ ) BLOCKS 是通过一些高度保守的蛋白质区域比对出来的无空位的片段。,模体数据库,蛋白质结构域数据库(1 ) 蛋白质家族序列比对以及隐马尔可夫模式数据库Pfam( protein families database of alignments and HMMs) Pfam 是蛋白质家族序列比对以及隐马尔可
13、夫模式数据库,其网址是: www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml。(2) 蛋白质结构域数据库ProDomhttp:/prodes.toulouse.inra.fr/prodom/doc/prodom.html(3) SMARTSMART 是一个简单的结构研究工具, 可对可转移的遗传因子进行鉴定和注解, 以及分析结构域结构, 可以检测出500 多个参与信号传导、胞外和染色体相关蛋白质的结构域家族, 对这些结构域又在系统进化树分布、功能分类、三级结构和重要的功能残基方面做了注解。http:/smart.embl-heidelberg.de/,3. 蛋白
14、质结构数据库,PDB( protein data bank , PDB) http:/www.rcsb.org/pdb/PDB 包括了蛋白质、核酸、蛋白质-核酸复合体以及病毒等生物大分子结构数据, 主要是蛋白质结构数据, 这些数据来源于几乎全世界所有从事生物大分子结构研究的研究机构, 并由结构生物学合作研究协会（RCSB） 维护和注释。,4.蛋白质结构分类数据库,(1) CATH 数据库www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cathnew/index.html(2) SCOP 蛋白质结构分类数据库( structural classification of protein dat
15、abase,SCOP) scop.mrclmb.cam.ac.uk/scop/index.html,三、蛋白质的序列分析,蛋白质理化性质是蛋白质研究的基础 蛋白质的基本性质： 相对分子质量 氨基酸组成 等电点（PI） 消光系数 半衰期 不稳定系数 总平均亲水性 实验方法： 相对分子质量的测定、等电点实验、沉降实验 缺点：费时、耗资 基于实验经验值的计算机分析方法,1.蛋白质基本理化性质分析,基于一级序列的组分分析 氨基酸亲疏水性等分析为高级结构预测提供参考 Expasy 开发的针对蛋白质基本理化性质的分析： Protparam 工具 http:/www.expasy.org/tools/pro
16、tparam.html,相对分子质量 氨基酸组成 等电点（PI） 消光系数 半衰期 不稳定系数 总平均亲水性 ,蛋白质理化性质分析工具,AACompIdent,PeptideMass,Protparam 工具 http:/www.expasy.org/tools/protparam.html 计算以下物理化学性质： 相对分子质量 理论 pI 值 氨基酸组成 原子组成 消光系数 半衰期 不稳定系数 脂肪系数 总平均亲水性,主要选项/参数,序列在线提交形式： 如果分析SWISS-PORT和TrEMBL数据库中序列 直接填写Swiss-Prot/TrEMBL AC号(accession number
17、) 如果分析新序列： 直接在搜索框中粘贴氨基酸序列,输入Swiss-Prot/TrEMBL AC号分不同的功能域肽段,输出结果,点击不同功能域或是以直接粘贴氨基酸序列的方式得到以下结果,正/负电荷残基数,37,原子组成,分子式,总原子数,不稳定系数,脂肪系数,总平均亲水性,40 unstable,(a)-Type I membrane protein (b)-Type II membrane protein (c)-Multipass transmembrane proteins (d)-Lipid chain-anchored membrane proteins (e)-GPI-anchor
18、ed membrane proteins,2、蛋白质亲疏水性/跨膜区分析,3、蛋白质亲疏水性分析,氨基酸侧链的疏水性用从各氨基酸减去甘氨酸疏水性之值来表示，蛋白质的疏水性在保持蛋白质三级结构的形成和稳定中起着重要作用。疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力 分析蛋白质氨基酸亲疏水性是了解蛋白质折叠的第一步 氨基酸疏水分析为蛋白质二级结构预测提供佐证 可用于分析蛋白质相互作用位点-抗原位点预测（预测准确率达56%） 是分析蛋白质跨膜区重要一步,海参溶菌酶亲水性/疏水性分析,Score 0，表示疏水性； Score 0，表示亲水性,螺旋跨膜区主要是由20-30个疏水性氨基酸（Leu、Ile、Val、Me
19、t、Gly、Ala等）组成 亲水残基往往出现在疏水残基之间，对功能有重要的作用 基于亲/疏水量和蛋白质膜区每个氨基酸的统计学分布偏好性量 TMpredhttp:/www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html SOSUI- http:/bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/,4、蛋白质跨膜区分析,常用蛋白质跨膜区域分析工具,TMHMM,ProtScale工具http:/ca.expasy.org/tools/protscale.html 氨基酸标度 表示氨基酸在某种实验状态下相对其他氨基酸在某些性质的差异，如疏水性、亲水性等 收集56
20、多个文献中提供的氨基酸标度 默认值以Hphob. Kyte & Doolittle做疏水性分析 特异性氨基酸标度，如Hopp & Woods（1981）针对抗原片段定位；Accessible residues（1979）针对氨基酸溶剂可及性定位；Chou & Fasman （1978）针对氨基酸二级结构疏水性分析,5、蛋白质亲疏水性分析,主要选项/参数 序列在线提交形式： 如果分析SWISS-PORT和TrEMBL数据库中序列 直接填写Swiss-Prot/TrEMBL AC号(accession number) 如果分析新序列： 直接在搜索框中粘贴氨基酸序列,是否归一化,输出结果输入Swis
21、s-Prot/TrEMBL AC号分不同的功能域肽段,所用氨基酸标度信息,分析所用参数信息,输出结果,（3） 跨膜区分析 蛋白质含有跨膜区提示它可能作为膜受体起作用，也可能是定位在膜上的锚定蛋白或离子通道蛋白。 例，使用TMHMM Server v.2.0在线分析 http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/,铝激活苹果酸的转运蛋白(TaALMT1)跨膜结构分析,6、跨膜区分析,TMpred工具：http:/www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html 预测跨膜区和跨膜方向 依靠跨膜蛋白数据库Tmbase,主要参数/选项,序
22、列在线提交形式： 直接贴入蛋白序列 填写SwissProt/TrEMBL/EMBL/EST的ID或AC,输出结果,包含四个部分 可能的跨膜螺旋区 相关性列表,跨膜拓扑模型及图示,SOSUI工具：- http:/bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/ 以图形方式返回结果，需要Java Applet程序,输入氨基酸单字母,运行,平均疏水值,预测的跨模螺旋区域,两种跨膜Helix,预测区域的螺旋示意图,平均疏水值,预测的跨模螺旋区域,两种跨膜Helix,59,亲疏水轮廓,跨膜蛋白序列“边界”原则 -Landolt Marticorena et al., 1993,胞外末端Asp、
23、Ser和Pro 胞外-内分界区域Trp 跨膜区Leu、Ile、Val、Met、Phe、Trp、Cys、Ala、Pro和Gly 胞内-外分界区域Tyr、Trp和Phe 胞内末端Lys和Arg,两股或两股以上螺旋相互缠绕而形成超螺旋结构 存在于多种天然蛋白质中，如转录因子、结构蛋白、膜蛋白中，在生物体内执行着代谢调控、分子运动、膜通道、分子识别等重要的生物功能，,63,7、蛋白质卷曲螺旋域分析,典型的有亮氨酸拉链，存在7残基 重复结构（heptad repeat)，以a，b， c，d，e，f，g位置表示，其中a和d位置为疏水性氨基酸，而其他位置 残 基为亲水性,蛋白质中由2-7条螺旋链相互缠绕形成
24、类似麻花状结构的总称； 主要存在形式是2-5条相互缠绕形成的平行或反平行同寡聚体或异寡聚体； 是控制蛋白质寡聚化的元件，转录因子、骨架蛋白、动力蛋白、膜蛋白、酶等；七肽重复区。,蛋白质卷曲螺旋域分析,蛋白质卷曲螺旋预测工具,COILS- http:/www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html COILS蛋白质卷曲螺旋预测方法基于Lupas算法，是目前主流的卷曲区域预测算法 一般滑动窗口的大小采用7的倍数,蛋白质卷曲螺旋分析,选择滑动窗口大小,选择打分矩阵和权重,选择输入格式，选择“SwissProtID or AC”,查询内容，输入“GO45_HUMA
25、N”,图形结果,8、信号肽预测信号肽：指分泌蛋白表达时氨基端的20余个氨基酸，将引导该蛋白质最终分泌至细胞外，但这段信号肽会被信号肽酶切掉，所以成熟的分泌蛋白是不含这段信号肽的。用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N末端的氨基酸序列，一般由15-30个氨基酸组成。使用SignalP在线分析 http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/,海参溶菌酶信号肽预测,Conclusion：cleavage site between pos. 20 and 21: ASG-QV,9、亚细胞定位 根据氨基酸组成可以进行亚细胞定位 不同细胞器多具不同的理化环境，它会根据蛋白质的结构及表面理化特征选择性容纳蛋白质；蛋白质表面直接暴露于细胞器环境中，它由序列折叠过程决定，而后者取决于氨基酸组成。 在线分析工具 e.g.使用TargetP http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/,组织蛋白酶CL和相关蛋白CLAP的亚细胞定位,结果证明，CL和CLAP出现几率最高的位点都为胞质，说明它们都为 胞浆内蛋白，这也为今年来在溶酶体内外都发现组织蛋白酶活性提供 了证据。,掌握蛋白二级结构、三级结构、结构域的概念 了解蛋白序列分析的内容,本节要求,
