1、淋巴细胞的分离、计数,中山医学院免疫学教研室 2013-04,实验目的和要求,掌握 外周血单个核细胞分离的方法掌握 细胞计数的方法,实验原理,外周血中细胞种类 细胞密度 红细胞和多形核白细胞 1.092淋巴细胞和单核细胞（PBMC） 1.075-1.092血小板 1.030-1.035葡聚糖泛影葡胺密度梯度离心法：根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度的细胞呈梯度分布，从而分离出PBMC。,实验材料,1. 肝素抗凝血2. Hanks液3. 淋巴细胞分离液（F-H)4. 水平离心机，加样枪5. 显微镜，吸管6. 细胞计数板，台盼蓝计数液,实验方案,抽取外周血,实验步骤,肝素抗凝静脉血1.5ml
2、,加1.5ml Hanks液稀释,置于2ml淋巴细胞分离液上,(交界液面：一定不要打乱),稀释后的抗凝血,淋巴细胞分离液,注意：稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上，使两者形成一个清晰地界面。,用Hanks液洗、离心 (1000rpm，5min) 重复2次,血浆,分层液,红细胞粒细胞,离心（2000rpm，25min）,淋巴细胞与单核细胞层,注意：细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，勿打破形成的细胞层。,用Hanks液重悬细胞,取10ul细胞悬液与90ul白细胞计数液或台盼兰计数液混合,取10ul于细胞计数板上,细胞计数,细胞计数板,细胞计数,原则：数上不数下，数左不数右,长1mm宽1mm,结果计算,2,2个大方格内细胞总数,单个核细胞浓度（细胞数/ml),10410,=,(稀释倍数）,细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色）,细胞数量：,方法评价,纯度在90%以上淋巴细胞约占90-95%细胞收获率可达80-90%活细胞百分率在95%以上,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：,细胞计数的仪器,Thanks!,注意事项,请将带血的试管，吸管收集放置于实验室后的红色消毒盆中。值日生负责收集加样枪，计数板，洗耳球，台盼蓝计数液，Hanks液。打扫实验室卫生。,
