1、实验六 感受态菌的制备1目的学会 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞。2原理细菌在 0C CaCl2 低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源 DNA 的状态。3器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。4试剂E. coli DH5，LB 培养基，0.1 mol/L CaCl 2 溶液，无菌 dd Water5实验准备1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌） 、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌） ；平板培养基，LB 培养
2、基（灭菌） ，冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液（灭菌） ，无菌 dd Water，摇菌试管（灭菌） ，三角烧瓶（灭菌） 。6操作步骤 （1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入 1.5 ml LB（不含抗菌素！）培养基。（2）从超低温冰柜中取出 DH5 菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含 2ml LB 培养基的试管中，37摇床培养过夜。（3）取 0.5ml 上述菌液转接到含有 50mL LB 培养基的三角烧瓶中，37下 250r/min 摇床培养 23h，测定 OD590 为 0.375（0.40.6，细胞数10 8/mL，此为关键参数！）
3、 。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。（4）将菌液分装到 1.5mL 预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置 10min，然后于 4，5000rpm 离心 10min。（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入 1ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置 30min。（6）4，5000rpm 离心 10min，弃上清液后，用 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液垂悬，插入冰中放置 30min。（7）4，5000rpm 离心 10min，弃上清液后，用 200L 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液垂悬，超净工作台中按每管 1
4、00L 分装到 1.5mL 离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80超低温冰柜中保藏（可存放数月） 。（8）在被细菌污染的桌面上喷洒 70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。7思考（1）制作感受态菌的过程中，应注意那些关键步骤？（2）CaCl 2 溶液的作用是什么？实验七 细菌转化1目的学会质粒 DNA 转化感受态受体菌的技术。2原理质粒 DNA 粘附在细菌细胞表面，经过 42C 短时间的热击处理，促进吸收 DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。3器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架
5、，干式恒温气浴（或恒温水浴锅） ，制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体 LB-Amp） ，超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。4试剂LB 培养基（不加抗菌素） ， LB 培养基（加抗菌素） ，无菌 dd water，IPTG，X-gal 。5实验准备无菌 dd water，1.5ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌） 、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌） ，20%IPTG （M/V） ，2% X-gal（M/V，用 N,N-二甲基甲酰胺配） 。6操作步骤 （1） 事先将恒温水浴的温度调到 42。（2） 从-70 超低温冰柜中取出一管（ 100L）感受态菌 DH5，插入冰上融化。（3） 加入 1
6、0L 连接好的质粒混合液（DNA 含量不超过 100ng） ，轻轻震荡后放置冰上30min。（4） 轻轻摇匀后插入 42水浴中 90s 进行热休克，然后迅速放回冰中，静置 12min。（5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入 1mL LB 培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上 37震荡 1h。（6） 在超净工作台中取上述转化混合液 100300L，分别滴到含合适抗菌素的固体 LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂） 。（7） 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加 40L 2% X-gal，7L 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。（8） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37恒温培养箱中 30-60min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入 37恒温培养箱过夜。（9） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。（10） 挑去单斑于相应抗性的培养基 1ml 中，37摇 3h4h，以菌液为模板 PCR 阳性检测。7思考（1）影响转化效率的因素有哪些？（3）白色菌落出现的原理是什么？
