1、原位杂交操作流程1原位杂交操作流程：步 骤 备 注材料的固定和包埋1、固定：将花芽浸入 20 倍于材料的 FAA 固定液中，抽气除去材料表面附着的气泡直至材料沉于容器底部，4 C 过夜（24h-72h） ，然后保存于 70%乙醇中。100mlFAA 固定液包含：乙醇 50 ml冰醋酸 5 ml37% 甲醛溶液 10 mlDEPC-H2O 35 ml2、脱水：材料经 70%，80%，90%，100% ，100%，100%乙醇脱水，每步 60 分钟。3、透明：依次经 25%二甲苯-75% 乙醇， 50%二甲苯-50%乙醇，75%二甲苯-25% 乙醇，100%二甲苯，100%二甲苯，100%二甲苯，
2、每步 45 分钟。4、浸蜡：50%石蜡-50% 二甲苯，42C 处理 24h，重复此操作一次，移入 60C 温箱，换入纯石蜡，60C 保温四天，每天换两次纯石蜡60C 石蜡过滤，超过 62C 可能会破坏石蜡结构5、包埋：包埋时注意除气泡石蜡包埋块 4C 可以保存 1 年以上切片1、载玻片：使用进口的处理好的载玻片。2、切片展片：42C 粘片四天。探针标记1、转绿反应（10l ）：线性化模板 200-300ng（2l ）5x Transcription Buffer 2l5x Labeling Mix 2lRNApolymerase 1lDEPC-H2O 2.5lRnase Inhibitor
3、1l37 C or 42C 反应 2 小时2、收集探针：1l 10mg/ml tRNA2.5l 4M Licl75l 100%乙醇， -20C 放置 2 小时，4C，1,2000 ，30 分钟70%乙醇洗涤沉淀，风干，溶于 50l DEPC-H2O 中。为使探针彻底溶解，可以在 60C 保温 15 分钟3、探针半定量：不同稀释倍数的探针和标准品点同样体积于尼龙膜，原位杂交操作流程2按照说明书进行显色。脱蜡、消化、乙酰化以下步骤要在无 RNA 酶的条件下进行，容器、溶液和工具均要灭菌。1、脱蜡复水：经过 100%二甲苯 20 分钟处理三次，检查脱蜡情况，然后：75%二甲苯-25% 乙醇 10 分
4、钟25%二甲苯-75% 乙醇 10 分钟100%乙醇 10 分钟100%乙醇 10 分钟90%乙醇 2 分钟80%乙醇 2 分钟60%乙醇 2 分钟 30%乙醇 2 分钟DEPC-H2O 2 分钟DEPC-H2O 2 分钟2、蛋白酶消化：37C 预热蛋白酶 K 缓冲液后加入蛋白酶 K至 5ug/ml，37C 处理载玻片 30 分钟，DEPC-H2O 洗 3 次蛋白酶 K 缓冲液 50ml：5ml 1M Tri-HCL pH7.55ml 500mM EDTA pH7.540ml DEPC-H2O 3、乙酰化：快速搅拌 100mM pH8.0 三乙醇胺溶液的同时加入乙酸酐至浓度 0.25%（ 25
5、0l/100ml） ，5秒后放入载玻片，室温下 5-10 分钟536l 三乙醇胺40ml DEPC-H2O160l 浓 HCL搅拌时加入 100l 乙酸酐 4、脱水：2xSSC 5 分钟2xSSC 5 分钟，系列乙醇脱水（可取消） ，干燥，准备杂交。杂交1、预杂交：45C 1-2 小时 注意往往会产生气泡溶液 A：7.72ml(分装备用):5000l formanmide1000l 50% dextran sulfate1000l 10xblock reagent600l 5M NaCl100l 1M Tri-HCl pH7.520l 500mM EDTA pH7.5溶液 B：22.8l 2.
6、5l 20g/l polyA1.5l 10mg/ml tRNA18.8l probe & DEPC-H2O80C 5mins 变性后与 A 混合2、杂交：湿室中 42C过夜。湿室中垫有 0.3MNaCl-50%甲酰胺饱和的吸水纸100l 杂交液： 77.2l 溶液 A+22.8l 溶液 B。原位杂交操作流程3洗片以后的操作和常规免疫组织学相似，不需要环境的特殊要求1、洗去杂交液：40ml 2xSSC 50C, 10mins40ml 2xSSC 50%formamide 50C, 30mins2、Rnase 缓冲液洗 2 次，每次 10mins3、RnaseA 处理：37C 预热 Rnase 缓
7、冲液，加 Rnase A 溶液到终浓度25g/ml，放入载玻片 37C 保温 30mins1000ml Rnase 缓冲液:29.22g NaCl0.37g EDTANa2.2H2O1.21g Tris加水溶解调节 pH 至 7.5 Rnase solution:100l 10mg/ml Rnase40ml Rnase 缓冲液4、低严谨洗：1xSSC RT, 30mins1xSSC RT, 30mins5、高严谨洗：0.5xSSC 50C, 30mins0.1xSSC 50C, 30mins检测1、1xPBT pH7.5 5mins，2、5% Blocking Reagent (2ml) in
8、 (40ml) 1xPBT pH7.5 60mins，3、1xPBT pH7.5 1mins，4、抗体结合 2h5、洗去未结合抗体：1xPBT pH7.5 20mins，1xPBT pH7.5 20mins，1xPBT pH7.5 20mins6、1xTNM50 5mins7、加底物溶液显色，RT 避光 30 mins-12h，勿晃动8、镜检照相9、系列乙醇脱水10、二甲苯透明封片保存200ml 10xPBT:2ml Tween 205.8g Na2HPO4.12H2O0.6g NaH2PO4.2H2O15.2g NaCl0.04g KCl溶解调节 pH 至 7.5（注意用时加 400l Tween 20）2.5U/ml 抗体溶液:135l 1xPBT, 15l 10mg/ml BSA,加 Anti-DIG-AP(1l)至2.5U/mlTNM50（pH9.5）:0.5ml 1M Tris pH9.50.25ml 1M MgCl20.1ml 5M NaCl4.15ml dH2O底物溶液：按 2% 的体积比取NBT/BCIP（3l）原液到 TNM50（147l） ，每张载片约需 150l
