1、Q-PCR 实验流程一、 总 RNA 抽提1)细胞培养皿中细胞样品用 1X PBS 洗两次后，用 1ml 枪将 PBS 吸干净，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至 1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置 5min;组织样品用液氮充分研磨，加入 1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放置 5min 使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)2)加入 200l 氯仿（5X），剧烈振荡混匀 1min，使水相和有机相充分接触，室温静置 3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好
2、，与第一步的顺序一致)3) 4下，14000g 离心 5min，可见分为三层，RNA 在上层水相，移至另一个新的 RNase free EP 管;(用 20-200ul 的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)4)沉淀 RNA：加入等体积（1:1）异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒 6-8 次)(不应用振荡器混匀)，室温静置 10min;5)4下，14000g 离心 15min，收集 RNA 沉淀(如离心后仍不见 EP 管底部有沉淀，应将 EP 管放置在-80 度冰箱过夜，继续在 4下，14000g 离心 10min，收集RNA 沉淀)，去上清;6)用 75%乙
3、醇洗涤两次，12000g 离心 5min(加入乙醇后只需轻轻颠倒 EP 管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，弃去上清液，空甩一次，以完全去除乙醇，开盖晾 35min，反复 2 次，挥干，使样品变透明。7)视沉淀量加入适量 DEPC 水(至少 15ul)溶解沉淀。，打散，备用。二、反转录1) 在 RNase free 的 PCR 管中配置下列溶液.Oligd T 1 ulRNA 4 ulDEPC 水 3 ul2) 将上述溶液吹打均匀，置 70保温 5min，使 RNA 变性。随后 4，保持5min， 以防止 RNA 复性;3) 在该 PCR 管中加入下列试剂（M-MLV Reverse Tr
4、anscriptate）E 1 uldNTP 4 ulMgcl2 3 ulM-MLV RT 5X buffer 4 ul4) 将上述 20l 反应溶液混匀，空甩，开始反转录：25保温 10min;42保温 60min;70保温 15min;4，。三、调 cDNA 浓度反转结束后，每个样品加入 80 ul 的超纯水，混匀，用微量分光光度计检测浓度，先用超纯水校准。20 ul（cDNA）+ 80 ul 超纯水100 ul（cDNA）然后将各样品的 cDNA 浓度调至 150 ng/ul.初始浓度 X 100 = 150 X （水 + 100）加水量 = 初始浓度 X 100/150 100.四、PCR:酶 E 10 ul模版 2 ul引物 2.5 ul20 ul 体系水 5.5 ul离心甩匀后，放入 PCR 扩增器中，设置反应体系。五电泳配胶：1.5%80 ml 1 X TBE + 1.2 g 琼脂微波 3 min，使之澄清，加入 8 ul Gelred 摇匀（与 TBE 1:10000），加入板上，排除气泡，放入梳子，静置。垂直拔出梳子，倒入 TBE 使之没过所有孔，上样，注意每行预留 Marker 位置，加样完成后，120 V 跑胶。
