1、质粒 DNA 提取1.质粒提取中各步离心时离心力怎么确定？离心时一般都用 12000rpm/min；也有一些方法是采用 10000rpm/min，对质粒的影响不大。但在提取大分子量质粒时，要特别注意离心的速度，速度过高会使质粒断裂。2.简介：葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部（可缺）EDTA：Ca2 和 Mg2 等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。溶液 I：可用等体积的水，或 LB 培养基代替NaOH：是最佳
2、的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。SDS：十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate， PDS） ，而 PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。该过程中携带了蛋白和基因组 DNA.4. 质粒 DNA 小量制备质粒 DNA 不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸
3、沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。个别小时制备物会出现无质粒 DNA 的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。5.涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。6.原先测序鉴定没有问题的细菌，37摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：1、降
4、低培养温度，在 2025下培养，或室温培养可明显减少发生概率。2、使用一些特殊菌株，如 Sure 菌株，它缺失了一些重组酶，如 rec 类等，使得质粒复制更加稳定。3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液中的 NaOH 浓度过高造成的7.在提质粒前判断菌生长是否正常：1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。2、肉眼观察活化菌株。 对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB 平板生长的 DH5A
5、正常形态在 3716h 后直径在1mm 左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。8.未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解：1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒 DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液
6、，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液 2 和 3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于 37保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如 TB 或 2YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少 LB 培养液体积。7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时 ) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心
7、尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。10、洗脱液不合适：DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液 EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于 pH 值，最大洗脱效率在 pH7.0-8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果 pH 过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至 60后使用，有利于提高洗脱效率。11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的
8、回收率可以增大洗脱体积。12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置 1min 可达到较好的效果9.细菌离心加入溶液 I 蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？参考见解：1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS 将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负 80保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。3、判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。如果发现呈泥水状
9、，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。10.为什么加了溶液后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出来的条带几乎没有，但是RNA 很亮（没加 RNA 酶）？参考见解：溶液主要就是 NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清。1、可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO2 失效。RNA 在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较 DNA 明显的条带。2、可能是菌量大，加溶液后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下3、可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高如果是使用自己配的试剂，建议做中提
10、或大提；或者买试剂盒提用自己配的试剂，不加 RNA 酶，最后 RNA 是很亮的，要去除干净就要用比较好的酶。4、如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化（数量变多） ，很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等), 然后使用一般的发放。5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。11.加入溶液 II 后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？裂解不完全,参考见解：1、问题可能是发生在溶液 II 上。首先看看 10SDS 是否是澄清的？NaOH 是否是有效的？如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液 II 是否澄清没有沉淀？2、可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液 I/II/III 的体积。3、可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。
