1、1高效液相色谱法测定忍冬藤中木犀草素的含量摘要目的： 建立忍冬藤中木犀草素的含量测定方法。方法： 采用高效液相色谱法；Agilent ZORBAX SB- C18 （4.6 mm X250mm）色谱柱；流动相：甲醇-0.3% 磷酸水溶液（47：53） ，流速为每分钟 1ml; 柱温 30，检测波长为 350nm。进样量 10l，等梯度洗脱，对其进行含量测定。结果 该方法简便、准确，适用于忍冬藤的质量控制。关键词忍冬藤；没忍冬藤为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）的干燥茎枝，我国忍冬属植物资源丰富，共有 98 种，分布于全国各个省区，尤以西南各省最多。忍冬藤收载于
2、2010 年版一部，具有清热解毒、疏风通络功能。临床用于温病发热、热毒血痢、痈舯疮疡、风湿热痹。中国药典 2010 年版一部将绿原酸作为忍冬藤质量控制的指标，但忍冬藤除了含绿原酸外，还含有环烯醚萜苷类、黄酮类、皂苷类等成分，现代药理研究表明忍冬藤中有机酸和黄酮类均有明显的生理活性，绿原酸和咖啡酸具有显著的抗菌作用，木犀草素等黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多种药理作用，现已备受人们关注，因此，仅以绿原酸作为忍冬藤质量控制的指标，存在一定的局限性，有必要建立多指标评价该药材质量的分析方法，为此，我们经过不断地研究摸索，建立了忍冬藤中木犀草素的含量测定方法，并对三批忍冬藤药材进行了含量测
3、定，结果显示该方法简单、快速、可靠，可用于忍冬藤药材的质量控制。木犀草素的含量测定：1、 仪器与试药色谱条件的确定仪器与试剂：日本岛津 2010 型高效液相色谱仪，自动进样器、紫外检测器、岛津 2010 化学工作站数据处理。甲醇为色谱纯，2水为超纯水，其他试剂皆为分析纯。色谱条件的选择：色谱柱：Agilent ZORBAX SB- C18 4.6X250mm，流动相为甲醇-0.3%磷酸水溶液（47：53） ，流速为每分钟 1ml; 柱温 30，检测波长为 350nm。进样量：10l；理论塔板数按木犀草素峰计算不低于 5000。依上述色谱条件，精密吸取木犀草素对照品溶液和供试品溶液各 10，分别
4、进样。在对照品溶液和供试品溶液色谱图相应位置上，有相同保留时间的色谱峰。见图 1、2。0. 5.010. 15.020. 25.030. min0.2.5mVDetctor A:350nm 19.825图 1 木犀草素对照品色谱图30. 5.010. 15.020. 25.030. min0.0.51.0mV(x10)Detctor A:350nm 19.831图 2 供试品色谱图2、提取条件的选择：我们在忍冬藤药材中木犀草素的提取过程中，采用了超声提取法和热回流法。2.1、供试品溶液的制备：分别精密称定过 40 目筛的药材粉末各2.0g，其中一份放置于 50l 具塞锥形瓶中，精密加入 80%
5、甲醇25l,密塞，称定重量，超声处理（功率 250W，频率 25Hz）30分种，放冷，用 80%甲醇补足减失的重量，摇匀，用 0.45滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液 1；另一份用 75%乙醇加热回流 3 次，每次 25l，每次回流 1.5 小时，合并提取液。回收乙醇至无醇味，并置于蒸发皿中水浴蒸干，用适量甲醇将提取物溶解并转移至25l 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用 0.45滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液 2。2.2、对照品溶液的制备：取木犀草素对照品适量，精密称定，制成每l 含木犀草素 1.5的溶液，即得。4测定方法：分别吸取对照品溶液和供试品溶液各 10l，注入液相色谱仪，测定，
6、即得。测定结果见表 1。表 1 提取条件的选择提取方法 序号取样量（g）对照品峰面积 样品峰面积含量（ %）热回流法12.0074 59091.5 73008.5 0.00231超声提取法 2 2.0058 59091.5 43678.5 0.00139通过上表可以看出，热回流法提取物中木犀草素含量比超声提取法提取物中木犀草素含量高 67%，说明热回流法提取木犀草素效果很好，因此，本次研究决定采用热回流法做为忍冬藤中木犀草素的提取方法。2、 对照品来源：购于中国药品生物制品检定所，木犀草素批号为 111520-200504，供含量测定用，符合对照品纯度要求。3、 线性关系考察：精密称取干燥至恒
7、重的木犀草素对照品 10mg，置 100ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得木犀草素浓度为 0.1mg/ml 的对照品溶液。分别吸取对照品溶液0.5ml，1ml，1.5ml， 2.0ml，2.5ml ，分别置 100 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别得含木犀草素50.5g/l、1.0g/l、1.5g/l、2.0g/l 、2.5g/l 的对照品溶液，按上述色谱条件测定，结果见表 2，以峰面积为横坐标，木犀草素含量为纵坐标绘制标准曲线（见图 3） ，回归方程为 f(x)=2.43721e-005*x+0.074959，相关系数 r=0.9996。结果表明木犀草素在 0.5g/l 2
8、.5g/ l 范围内线性关系良好。表 2 标准曲线的制备对照品浓度（g/l）进样体积(l) 峰面积0.51.01.52.02.5101010101017691.5375535969177747100284Y = aX + ba = 2.437206e-005b = 7.495904e-002R2 = 0.9991040R = 0.9995519External StandardCurve Fit Type:LinearOrigin:Not ForcedWeight:NoneMean RF : 2.619070e-005RF SD : 1.334630e-006RF %RSD : 5.09581
9、760 25000 50000 75000 Area0.00.51.01.52.02.5Conc.图 3 木犀草素标准曲线（5）精密度试验：取批号为 20070301 的忍冬藤药材制备供试品溶液，连续进行六次测定，根据峰面积计算，结果见表 3。木犀草素的相对标准偏差为 0.15%，表明精密度良好。表 3 精密度试验结果序号 峰面积 平均值 RSD（%）12345672678725907275972563725007276572642.5 0.15（6）稳定性试验：取批号为 20070301 的忍冬藤药材样品制备供试品溶液，分别在 0、2、4、8、24 小时进样 10l，连续测定五7次，计算木犀
10、草素的相对标准偏差，结果见表 4。木犀草素的相对标准偏差为 0.04%，表明在 24 小时内，供试品稳定性良好。表 4 稳定性试验序号 峰面积 平均值 RSD（%）12345726797273172783727447273772734.8 0.04（7）重现性试验：对批号为 20070301 的忍冬藤药材样品制备供试品溶液，独立进行五次测定，计算其相对标准偏差，结果见表5。木犀草素的相对标准偏差为 0.52%，表明方法重现性良好。表 5 重现性试验序号取样量（g）对照品峰面积 样品峰面积含量（%）平均值（ %）RSD（ %）123452.00351.98691.99952.00162.0047
11、58170.57335872172.57248672679735240.002370.002330.002340.002350.002370.002352 0.768（8）回收率试验：采用加样回收法。精密称取样品 5 份（批号为 20070301，其中木犀草素含量按 5 次测定平均值计算，为0.0023506%） ，每份称样量约为 1.0 g，置平底烧瓶中，精密加入浓度为 50.1g/l 的木犀草素对照品 0.5l，按忍冬藤药材样品制备供试品溶液的制备方法操作, 按 1 项下的色谱条件进样 10测定，计算回收率。结果见表 6。其平均回收率为 100.79%，符合要求。表 6 回收率试验样品称样
12、量（g）样品中木犀草素含量（ g）对照品加入量(g)测得总量(g)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)1.00101.00681.01281.00191.03561.046923.529523.665823.806923.550724.342824.608425.0525.0525.0525.0525.0525.0548.198248.769349.496148.282049.930550.320598.48100.21102.5598.73102.15 102.64 100.79 1.90 通过以上方法学考察，说明含量方法稳定可行，故列入正文。按照上述方法，对 3 批药材中木犀草素的含量
13、进行了测定，每个样品单独测定二次，结果见表 7。表 7 3 批药材中木犀草素的含量批号 木犀草素的含量（ %）0.00235200703010.002350.002350.00240200703020.002420.0024190.00245200703030.002450.00245本实验采用高效液相色谱法对三批忍冬藤中的木犀草素进行了含量测定，方法操作简便、结果准确、专属性强，测定结果显示，但含量都较少，方法是简便、快捷和准确可行的。忍冬藤收载于 2010 年版一部，具有清热解毒、疏风通络功能。临床用于温病发热、热毒血痢、痈舯疮疡、风湿热痹。中国药典2010 年版一部将绿原酸作为忍冬藤质量控制的指标，但忍冬藤除了含绿原酸外，还含有环烯醚萜苷类、黄酮类、皂苷类等成分，现代药理研究表明忍冬藤中有机酸和黄酮类均有明显的生理活性，绿原酸和咖啡酸具有显著的抗菌作用，木犀草素等黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多种药理作用，现已备受人们关注，因此，仅以绿原酸作为忍冬藤质量控制的指标，存在一定的局限性，有必要建立多指标评价该药材质量的分析方法，为此，我们经过不断地研究摸索，建立了忍冬藤中木犀草素的含量测定方法，并对三批忍冬藤药材、三批忍冬藤药材和三批含忍冬藤的中成药“妇炎净胶囊”进行了含量测定，结果显示该方法简单、快速、可靠，可用于忍冬藤药材的质量控制。10
