1、 幽门螺杆菌概述 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是一种世界范围人类感染的病原菌，在人群中具有较高的感染率。Hp 在我国普通人群的感染率可达到 5080，并以每年 12的速度增加。由于部分 Hp 感染者会发展为慢性胃炎、十二指肠肠炎、消化性溃疡、胃癌、黏膜相关性淋巴瘤等疾病，WHO 癌症中心于 1994 年将 Hp 列为第一类致癌因子。对 Hp 感染的精确诊断可为医生治疗胃肠病人提供可靠的依据，指导临床用药。大量研究表明，早期采用根除 Hp 的预防治疗可明显降低胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等疾病的发生率，另有报道指出根除 Hp 治疗的人群发生胃癌的危险性明显降低。1.病
2、原学特征 Hp 是一种革兰阴性菌，专性微需氧，在体内呈螺旋杆状，在体外培养呈弯杆状。Hp 有单极鞭毛，具有很强的运动能力，可以穿透覆盖于胃黏膜上皮细胞的黏液层。其稳定生长需要依靠含 58氧气的微环境，最适温度 37， pH 值 6.67.2。延长培养时间典型形态的 Hp 会发生圆球样变化，生长环境不良、氧张力升高、碱性环境、温度升高或者阿莫西林干预均可导致球形变。 1.1 Hp 的基本形态 光镜下，Hp 是一种革兰阴性，S 形或弧形弯曲的细菌。电镜下，Hp 是一种单极多鞭毛、末端钝圆菌体呈螺旋形弯曲的细菌。在胃黏膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋或弧形。同培养细菌的形态相比，组织切片或活检组织涂片上
3、观察到的细菌更小，弯曲更明显。1.2 Hp 的超微结构 电镜下，菌体的一端可见 47 条带鞘的鞭毛。分裂时，则两端均可见鞭毛。每一鞭毛根部均可见一圆球状根基，位于菌体细胞壁内侧，鞭毛由此向菌体外伸出，鞭毛是 Hp 的动力器官。细菌经鞣酸处理，可见包裹其外面厚达 40 nm 的糖萼。电镜下，它呈细丝网状与胃黏膜上皮细胞连接，称之为纤毛或菌毛，菌毛是黏附于胃上皮细胞表面的主要物质基础。 1.3 基因组结构及特征 Hp 的基因组大小变化范围为 1.61.73 Mbp ，平均大小为 1.67 Mbp 。以 Hp 26 695 为例，其染色体为环状，大小为 1 667 867 个碱基对，平均 GC 含量
4、为 39。基因组中有 5 个 GC 含量相差很大的区域。其中 2 个区域含有 1 个或多个 IS605 拷贝，两侧为 5SrRNA 序列和 521 bp 的重复序列。另有 1 个区域为 Cag-PAI，两边是 31 bp 直接重复序列，它可能是有菌株间基因转移导致。 2.主要致病基因 2.1 ure 尿素酶基因 Hp 尿素酶产生的 NH 3 可引起小鼠体内胃的急性损伤，同时可以加速体外胃上皮细胞的死亡。按照 Hp 感染病人胃中的 NH 3 浓度，长期的 NH 3 刺激，可增加上皮细胞的增生、更新，同时加速上皮细胞的死亡、脱落，首先丢失的是胃壁细胞及萎缩的胃黏膜细胞。NH 3 对胃黏膜的损伤作用
5、是 pH 依赖型的，然而氢氧化钠所致相同的 pH 值并不引起胃黏膜的损伤2.2 cag 细胞毒素相关基因 cag 致病到编码 cagPAI 蛋白的产生，cag PAI 含有 31 个假定的基因，包括 cagA 和另外一些编码 IV 型分泌系统的基因。IV 型分泌系统扮演着分子“注射器”的角色，通过它大分子可以从细菌内注射到上皮细胞的细胞质中。Hp cagA 阳性的细菌比 Hp cagA 阴性的细菌可引起更高程度的炎症，且与严重的萎缩性胃炎及胃腺癌密切相关。来自亚洲的调查多显示 cag 阳性菌株与胃癌、消化性溃疡和慢性活动性胃炎无关。但是，也有意见认为亚洲人群中 cag 阳性率普遍过高，在病例及
6、对照组中近乎相等，在样本数不够大时，不能排除产生类统计学误差的可能。有报道 cag PAI 可触发胃上皮细胞的信号级联反应，引起 NF-B 的激活及其他细胞反应。此外 cagA 可嵌入宿主细胞，在其内发生磷酸化，进而通过信号途径引起上皮细胞形态学的变化。cag PAI 可能间接刺激活性氧化合物的过多产生，包括氧化亚氮等，同时导致程序性细胞死亡.2.3 vacA 细菌空泡毒素基因 Vac 能诱导上皮细胞产生空泡变性，刺激上皮细胞凋亡。其编码基因存在于所有 Hp 中，但仅约 50的菌株能产生有活性的空泡毒素，可能与 Vac 存在多种亚型有关。vacA 在不同地域、种族中，亚型不同，毒素活性水平各异
7、。vacA 基因分为信号序列和中部基因。根据 vacA 基因信号序列的不同，分为 s1 型和 s2 型；其中 s1 型又分为 s1a、s1b 型，中部基因分为 m1 型和 m2 型。s1m1 型 Hp 菌株产生的毒性水平最高，s1m2 型产生低至中等程度的毒性，s2m2 型无毒性，而基因型为 s2m1 的菌株极罕见。中国vacA 基因型多为 s1m2 型。美国 s1/ m1 和 s2/ m2 的 Hp 各占 50%。德国有一半 Hp 临床株为 s1/ m2，日本的 Hp vacA 基因表型单一，以 s1a/ m1 型占优势，占 90%以上。 2.4 babA 编码外膜蛋白 BabA（Hp 黏附
8、素）的产生 BabA 能结合到胃上皮细胞的 Lewis b 血型抗原上。Hp 某些菌株的脂多糖(LPS)在胃黏膜上表达类似 Lewis x 和 y 血型抗原的结构 BabA。这种抗原模仿作用可导致抗病原菌抗体的免疫耐受或被识别胃上皮细胞的自身抗体感应，此现象常常在慢性活动性胃炎病人中观察到。表达 BabA 的菌株与胃上皮细胞结合得更加紧密，已有明显的证据证明 BabA 表达的积累会影响疾病的严重程度，同时含有 babA，vacA 和 cagA 基因的 Hp 菌株导致胃癌发生的危险性最高。 2.5 iceA 编码接触上皮诱导的毒力因子 在 Hp 与上皮细胞相接触时产生，含 iceA1 与 ice
9、A2 两个亚型。目前 iceA2 的功能还不很清楚，但已发现 iceA1 基因与奈瑟菌属 II 型限制性内切核酸酶编码基因 nlaIII 有明显的同源性。iceA1 在 Hp 与上皮细胞接触时表达上调，在一些人群中与消化性溃疡的发生有关。Donahue 等报道 iceA1 的转录与编码高保守 DNA 腺嘌呤甲基转移酶 Hp IM 基因的转录有关。因此，iceA1 在体内可能通过转录调节 Hp IM 的表达水平来影响 Hp 的致病力（首先是 DNA 甲基化方式的改变引起基因表达的改变，进而导致细菌毒力的变化） 。 3 流行病学 3.1 传播途径 3.1.1 粪口途径 Hp 能从胃返流入口腔，使口
10、腔成为 Hp 的储存库，而唾液则成为 Hp 的传播媒介，这种观点已由细菌学及流行病学调查证实。牙斑中发现 Hp 也是粪口传播的有力支持。对于其在人与人之间的传播方式，流行病学调查结果显示，西非儿童的 Hp 感染率高，可能是由于他们的母亲习惯于先将食物嚼碎后再喂孩子引起的。中国是世界上 Hp 感染率高的国家，其原因与共同食用的传统习惯而导致 Hp 粪口传播有关。 3.1.2 粪口途径 粪便中找到 Hp 是对粪口途径传播的有力支持。经粪便排出体外的 Hp 在周围能够存活也是经粪口途径传播的必要条件。一般认为 Hp 在环境中存活能力较差，在室温空气中暴露条件下只能存活数小时，但当 Hp 发生球形变后
11、，代谢率明显减低，对各种抗生素的抵抗力普遍提高。 3.1.3 经内窥镜传播 内窥镜是临床诊断胃病的重要工具，因暴露于胃液及唾液，常用的胃镜及活检钳易被 Hp 污染。常规清洗及用 70酒精消毒不能清除 Hp，需用戊二醛浸泡方可杀灭。3.2 分布特征 3.2.1 国家和地区 Hp 感染呈全球分布，凡进行过 Hp 调查的国家和地区，均得到了阳性结果，感染率从 179不等，多数地区在 50左右。西方经济发达国家的 Hp 流行表现特征为：40 岁以下人群的感染率达 20，而 60 岁以上人群的感染率高达 50以上；儿童感染少见；移民可造成某些西方国家偏远地区的高流行。 在发展中国家，Hp 感染率普遍偏高
12、，特别是儿童期感染率更高，10 岁以内人群感染率已达 50，30 岁时继续上升至 75以上，然后趋于稳定。其中智利北部儿童和青少年的 Hp 感染率是 70，越南、印度、中国青少年 Hp 感染率分别为 40、79、60。 3.2.2 种族分布 同一发达国家内部，不同民族有不同的 Hp 感染率。澳大利亚、埃塞俄比亚、萨尔瓦多的中国移民者 Hp 感染率分别为 43、40、60，而澳洲土著人仅为 0.5，白人为 31。在美国，黑人的 Hp 感染率（70）明显高于白人（34） 。在新西兰，汤加血统移民 Hp 感染率为 70，萨摩亚及库克岛移民分别为 44及 39，而白人仅为 15。 造成种族之间 Hp
13、感染率差异的原因可能与居住条件、文化习俗、社会经济状况等因素有关，是否与遗传因素有关仍不清楚。对双胞胎 Hp 感染情况的分析表明，环境对 Hp 感染的影响要远远超过遗传的作用。 3.2.3 年龄与性别分布 Hp 感染的发生与年龄有一定的关系，这种关系在不同的国家和地区有一定的差异。法国 10 岁以下儿童 Hp 感染率很低，仅 3.5，65 岁以上达 36.7。越南儿童感染率相对成人较低为 13.1，多数人在 1030 岁期间感染，大于 30 岁的人群 75以上可检测到抗 Hp 抗体。 我国广州地区也有 Hp 感染率随年龄增长的现象。其增长曲线可分为三个时期，其一是“剧增期” ，见于 5 岁以内
14、儿童，感染率以每年约 4的增幅上升，5 岁已达 23.6；第二是“缓增期” ，见于 540 岁的人群，感染率每年约增加 1；第三是“平坦期” ，见于 40 以上人群，感染率基本不再上升。另有报道我国兰州地区 Hp 感染率随年龄增长的模式与广州地区相似。然而定群研究的结果认为 Hp 感染与年龄的关系是一种群组现象。多数资料表明 Hp 感染率在男女性别间无显著差异。3.2.4 社会环境因素的影响 世界范围流行病学研究发现，Hp 相关胃炎的患病率与人群的社会经济因素有着密切的关系。社会因素表现在许多方面，包括生活条件，经济收入，文化水平，人口密度和职业等。它既可以促进疾病的蔓延，也可以成为有效防治和
15、消灭疾病的主导因素。 4 幽门螺杆菌相关疾病 4.1 幽门螺杆菌与胃炎 正常情况下，胃壁有一系列完善的自我保护机制（胃酸、蛋白酶的分泌功能，不溶性与可溶性黏液层的保护作用，有规律的运动等） ，能抵御经口而入的千百种微生物的侵袭。自从在胃黏膜上皮细胞表面发现了 Hp 以后，才认识到 Hp 几乎是能够突破这一天然屏障的唯一元凶。尽管也有报道另一种人胃螺旋菌（Gastrospirilum hominis,Gh,现又有人称之为 Helicobacter heilmanii）亦能在人胃壁上定植，但其阳性检出率所占比例平均一般仅及 Hp 的 1%以下。Goodwin 把 Hp 对胃黏膜屏障的破坏作用比喻为
16、“屋顶”的破坏给屋内造成灾难那样的后果，故称为“屋漏”学说。目前对 Hp 感染的研究能归入这一学说的资料最多。主要包括：使 Hp 穿透黏液层在胃上皮细胞表面定植的因素； 对胃上皮细胞等起破坏作用的毒素因子；各种炎症细胞及炎症介质；免疫反应物质等。这些因素构成 Hp 感染的基本病理变化，即各种类型的急、慢性胃炎。其中近年来得到最重要关注的是空泡毒素 VacA、细胞毒素相关蛋白质 CagA，和尿素酶等的作用及其分子生物学研究。Hp 虽不是引起胃炎的唯一原因，但却是最重要的原因之一，尤其是慢性活动性胃炎，Hp 检出率高达 95%。Hp 是非侵袭性病原，能引起强烈炎症反应。它的机制主要是：直接刺激免疫
17、细胞，使之趋化或活化，大量分泌细胞因子，如 IL-8 和多种抗体，但这些抗感染因素不能从根本上清除 Hp，反而造成 Hp 感染部位的持续炎症反应，造成胃炎。 4.2 幽门螺杆菌与消化性溃疡 消化性溃疡包括胃溃疡和十二指肠溃疡，两者在发病机制上有许多相同之处，但也存在着明显差异。防御因素的削弱在胃溃疡中占主导地位，而损害因素的增强是十二指肠溃疡的主要病因。消化性溃疡与慢性胃炎几乎都合并存在，而且在消化性溃疡发生之前大多先有慢性胃炎，进而才转为消化性溃疡。 4.2.1 胃溃疡 与胃炎一样，Hp 也不是引起胃溃疡的唯一原因，但却是最重要的原因。它的机制主要是：Hp 感染后的炎症造成胃黏膜损伤，而损伤
18、的胃黏膜不能有效低御胃内的低酸度而造成溃疡。 4.2.2 十二指肠溃疡 目前导致十二指肠溃疡的致病机制尚未完全明确，但 Hp 感染无疑是十二指肠溃疡发病的重要原因。一般认为 Hp 引发的十二指肠溃疡可能的学说主要是胃上皮化生学说，此学说认为 Hp 感染后造成胃酸异常分泌，引起十二指肠内的胃上皮化生，Hp 定植与十二指肠内的胃化生上皮，引起黏膜损伤并导致十二指肠溃疡形成。但也有学说认为 Hp 并不直接定植于十二指肠，而是通过它感染后引起的细胞毒素，炎症介质及持续的免疫反应造成十二指肠损伤，并引起溃疡。 4.3 幽门螺杆菌与胃癌 胃癌是世界上肿瘤中仅次于肺癌的死亡原因。美国胃癌于 1930 年占肿
19、瘤死亡原因首位。到现在已下降到较低水平（1985 年为第 910 位） ，这一发生率的显著下降有利于研究这一疾病的致病机制。事实上，作为结果，胃癌可被认为在人类恶性病变中了解最清楚的。自从发现了 Hp 以后，对胃癌的发生提出了一些新的看法。 Hp 感染引起的细胞增殖，包括：复制错误，内源性炎症相关突变原，饮食中外源性突变原 3 种机制增加对 DNA 损坏的危险性。大多数损坏的 DNA 能被机体正常的保护机制所修复。但是检查和修复的能力并不总是那样的完美无缺。上皮细胞中引起的有些 DAN 损坏可保留很长时间。感染期越长，不适当的修复可能性越大，最后转化成恶性。人们感染 Hp 在年青时期，他们产生
20、明显的炎症反应，会增加肿瘤的危险性。假若这些人饮食中会有较高的外源性致癌原和较低的抗氧化剂，它们的危险性会互加起来。虽然有些个体中感染或饮食已能单独解释肿瘤的成因，但两者的互加更能显示它们之间的协同作用。 目前认为的癌变模式为：慢性胃炎萎缩性胃炎肠化生不典型增生胃癌。胃癌的发病与较早感染 Hp（如儿童期感染）的不同毒力菌株等都相关。现在认为：Hp 感染主要作用于癌变的起始阶段，即在活动性胃炎，萎缩性胃炎和肠化生的发展中起主要作用，而 Hp 引起的长期炎症反应是主要的致癌内毒素。此外，胃相关性淋巴瘤也与 Hp 感染呈密切相关性，致病机制也主要是长期炎症反应导致的致癌内毒素。关于这两种癌变还有待更
21、深入的研究。 4.4 幽门螺杆菌与非消化道疾病 Hp 与非消化道疾病关系的研究正在开展，但这些研究多基于临床观察，尚需更多的实验研究及严格设计的前瞻性临床研究。报道较多的情况为 Hp 与冠心病、高血压、偏头痛、小儿发育不良、酒糟鼻、荨麻疹、肝病高血氨、口臭、胆石症、肝硬化、糖尿病、缺铁性贫血有关。 5 检测方法 5.1 微生物学方法 主要为细菌分离培养技术，是诊断 Hp 感染的“金标准” 。将标本接种于培养液，依据培养结果，判定感染与否。理论敏感度应是 100%，Hp 系微需氧菌，对气体环境、温度以及培养液种类等均敏感，而培养结果亦受上述因素影响。但随培养技术的完善，有报道表明敏感度已可达 9
22、5 %以上。Hp 成菌落后可凭菌落、细菌形态及生化反应鉴定，特异度 100 %。因此，此法常作为其他检验方法的金标准。但 Hp 定植于胃窦部，胃镜取材宜在幽门前 5 cm 内。由于服用抑酸剂者 Hp 可从胃窦部向体部转移，故应从体部钳取组织。标本取出后需立即放入转送液(如 20%葡萄糖液、生理氯化钠)，置于- 20或 4冰箱中，在允许时间内接种。接种方式有匀浆划线和直接划线两种。常用的培养液有哥伦比亚琼脂、脑心浸膏、改良 Skirrow 培养液等。因需要特殊设备，操作过程复杂，观察结果时间长(37 d) 和费用昂贵，而且敏感度差(70 % 左右)，并常易出现假阴性结果，临床应用较少。 5.2
23、血清学方法 Hp 能激发宿主局部和系统免疫反应，导致机体内 IgG，IgA 增高，根据 Hp 菌体或表面存在多种抗原成份的功效制成不同的抗原剂，在此基础上建立起一系列血清学检测方法，试验灵敏度和特异度分别是 98.7 %和 100 % 。但血清中的抗体不能正确反映患者的感染状态，因此只能作流行病学筛检而不用于临床诊断。目前已有的血清学方法如下述。 5.2.1 ELISA 检测 酶联免疫吸附试验(ELISA)是测定血清抗 Hp 抗体的方法，敏感度和特异度较高，但这一方法仅反映 Hp 感染，不能确定现症感染和用于药物疗效的评估，随着 Hp 的根除，血清抗 Hp 抗体效价逐步下降或转阴性，故 ELI
24、SA 法仅适用于流行病学调查和回顾性研究。 5.2.2 免疫印迹法 血清 Hp 抗体检测，以上海元谷科技发展有限公司生产的 Hp 免疫印迹试剂盒为例。原理是先将 Hp 的混合抗原用 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，按分子量不同分开，再将其转移至硝酸纤维膜上，如果被检血清有相应抗体，应用酶联免疫吸附反应，就会在抗原的相应位置出现显色区带，据此可测定细胞毒素相关基因蛋白(CagA) 、空泡毒素(Va2cA) 、尿素酶 A(UreA) 、尿素酶 B ( UreB) 、鞭毛蛋白 5 种抗体，并判断 Hp 感染类型。试验可手指采血也可静脉采血，两种方法不影响实验结果。缺陷除前述不能正确反映患者的感染状态，亦
25、不能进行定量检测。 5.2.3 免疫层析分析法 检测原理：采用高度特异度的抗体抗原反应及免疫层析分析技术来定性检测血清/血浆中是否含有抗 Hp 抗体。以艾康生物技术（杭州）有限公司生产的 ACON Hp 检测试剂盒为例，试剂盒含有被预先固定于膜上测试区（T）的鼠抗人抗体和质控区（C）的相应抗体。测试时，将血清/血浆标本滴入试剂盒加样孔（S）内，血清 /血浆标本与预包被的乳胶颗粒结合的 Hp 抗原反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如为阳性，乳胶在层析过程中先与标本中的抗 Hp 抗体结合，随后结合物会被固定在膜上鼠抗人抗体结合，在测试区（T）内会出现 1 条红色条带。如为阴性，则测试区（
26、T）内将没有红色条带。无论抗 Hp 抗体是否存在于标本血样中，1 条红色条带都会出现在质控区（C）内。质控区（C ）内所显现的红色条带是判定标本足够与否、层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 5.2.4 蛋白芯片法 西安联尔生物技术有限公司生产的 Hp 抗体蛋白芯片检测系统可同时检测 Hp 的 Ure、Cag 、Vac 抗原的存在，并对 Hp 进行分型，但不能确定现症感染。 5.2.5 Western-blot 主要用于分析感染者血中对 Hp 多种抗原组分的抗体产生情况。可以控制抗原制备质量和分析其他类似细菌的交叉反应等。但操作复杂、技术难度大且不稳定，已不作常规诊断方法。 5.
27、2.6 粪便 Hp 抗原检测(Hp stool antigen test ,HpSAT) 系以酶联免疫法(enzyme immunoassay ,EIA) 检测粪便中 Hp 抗原，反映消化道 Hp 感染状况。其敏感度、特异度较高，Chang 等以 HpSAT 对 33 例患者进行研究，其敏感度和特异度分别为 95 %和 100 %，而 Varia 等对 501 例患者的研究结果显示敏感度、特异度分别为 94 %和 98 %。 5.2.7 幽门螺杆菌抗体金标检测盒 Hp 抗体胶体金快速检测是对人血清中的 Hp IgG 抗体的定性测。检测原理 Hp 抗原包被在渗滤膜上，可捕获样本中特异性抗体，形成
28、抗原抗体复合物。此复合物再与胶体金偶联物结合，从而在膜上形成 1 个红色斑点。膜上另 1 个红色斑点是质控点，用来检验试剂盒的可用性。 结果分析：出现 1 个红色斑点为阴性；出现 2 个红色斑点为阳性。阳性结果：测试孔内出现 2 个红色斑点，1 个位于 T 侧，1 个位于 C 侧。 阴性结果：测试孔内出现 1 个位于 C 侧的红色斑点。 无效结果：测试孔内无红色斑点，或出现 1 个位于 T 侧的红色斑点。 局限性：使用冰冻或者解冻后的样本（尤其是重复使用的）易浑浊或出现沉淀，会阻塞膜导致渗滤速度慢，从而出现深背景颜色，使得结果难以分辨。 5.3 尿素酶依赖技术 目前已有不少医院应用以此项技术为
29、基础的检验试剂盒，但存在不能分型，灵敏度、特异度不高，或需要特定仪器，所用材料含放射性等缺点。 5.3.1 快速尿素酶实验(rapid urease test ,RUT) 由 Mcnalty 和 Wise 创建于 1985 年，其原理是利用 Hp 菌体所含特征性尿素酶与尿素反应产生 NH 3 及 CO 2，从而改变反应体系的 pH 值，并通过指示剂显色达到检测目的。其特异度(95% 100%)，而敏感度受环境、温度、反应时间、标本大小(阳性结果需菌量10 4 个)、Hp 治疗史、观察时间及观察者自身的影响，故不可单独作为 Hp 根除评价指标。 5.3.2 14C、13C 尿素呼气实验(14C、
30、13C - urea breath test ,UBT) 口服 14C、13C 标记的尿素后，利用 Hp 菌体所含特征性尿素酶与该尿素反应产生 14CO 2、13CO 2，吸收入血并经肺呼出，用闪烁计数器或质谱仪检测 14CO 2、13CO 2 含量，即可判断是否感染 Hp。14C-UBT 敏感度、特异度分别为 99%、93%，13C-UBT 为 98%、96% 。其优点在于：非侵入技术、损伤小、并发症少；口服分布均匀、可避免采样误差。缺点在于：UBT 具有微放射性(37 kBq 相当于胸透的 1/ 7，钡餐的 1/1 000)，孕妇及儿童不宜；技术、设备要求高，尤其 13C-UBT 需质谱仪
31、；结果受消化道杂菌、服药、呼气间隔时间长短及所确定临界值高低的影响。 5.3.3 15N-尿氨排出实验 原理类似 14C、13C 尿素呼气实验，由我国学者吴继琮等首创。其方法是将口服 14C 或 13C 标记的尿素改口服 15N-尿素，Hp 菌体所含特征性尿素酶分解该尿素生 15NH 3 和 CO 2，15NH 3 随尿排出，以质谱仪测定 15NH 3，并计算 15NH 3 -尿排出率，从而达到检测目的。结果会受消化道细菌、服药、排尿间隔时间长短及所确定临界值高低的影响。 5.4 形态学方法 主要包括活检组织病理染色、涂片染色等，可以在显微镜下直接看到细菌，需要胃镜取材和判断经验。 将所取胃黏
32、膜标本切片或涂片染色镜检 Hp，其特异度较高(95%100%)，敏感度依赖于观察者的经验与技术，切片优于涂片。常用方法有：Warthin-starry 银染、HE、吖啶橙、Brown-Hopps 、Gimenez 、Grams 及 Giemsa 等。此法较简便，但细菌数量少时易漏诊，造成假阴性结果。 5.5 基因诊断 利用基因扩增技术，扩增 Hp 特征性基因片段，达到检测目的。PCR 有较高的敏感度和特异度并可检出细菌培养、组织学及 RUT 不能发现的少量 Hp (最少细菌数为 10100 个)，可灵敏地发现菌量减少但并未真正根治的病人。 5.5.1 PCR 产物电泳检测 不同目的片段长度不一
33、，将 PCR 产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以检测出样本中是否含有目的片段，因所选均为特异性基因片段，故可诊断相应细菌的感染。 5.5.2 限制性片段长度多态性分析(RFLP) RFLP 是用限制性内切酶消化 Hp 的扩增产物，由于酶切位点的不同 DNA 片段长度会有差异，再通过凝胶电泳分离这些片段，由此来判断 Hp 所含的毒力基因。限制性内切酶主要有 Rsa、Hae、Pst、Dde 等。RFLP 方法具有分辨率高、重复性好等优点，但操作比较复杂，实验条件要求高，不适合一般临床实验室使用。 5.5.3 PCR-ELISA 法 PCR-ELISA 法是一条引物用生物素标记，扩增后的 PC
34、R 产物放入预先包被抗生物素-链霉蛋白的微孔板反应，再同一组地高辛标记的混合探针杂交，最后加入抗地高辛-酶结合物和底物，根据所显颜色的深浅或所测的 OD 值就可判断 Hp-DNA 是否存在。 5.5.4 反向杂交技术 反向杂交技术是将 PCR 后产物与固相上的寡核苷酸探针杂交、显色以鉴定 Hp 感染的技术。主要有线性探针技术（line probe assay ,LIPA） 、线性杂交技术（ line blot assay, LBA） 、反向线性杂交技术（ reverse line blotting, RLB）和反向斑点杂交（reverse dot blot, RDB）4 种，基本原理相同，适于
35、大规模流行病学调查，但较难定量。 5.5.5 幽门螺杆菌致病岛基因芯片检测法 基因芯片技术指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样本分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样本分子的数量和序列信息的方法。具有高度并行性、多样化、微型化和自动化的优点，将基因芯片技术用于 Hp 的检测，具有灵敏度高，特异度强的特点，不仅能准确进行 Hp 感染的检测，而且可以进行 Hp 所含毒力岛的检测，但是该法需要特殊的仪器设备，检测的成本昂贵且目前应用于临床的报道不多。 5.5.6 荧光定量 PCR 法 该法是最敏感的核酸扩增技术，非常准确和精密。因为是在反应过程中进行分析而不是反应之后，避免
36、了 PCR 后的产物分析，可在较短的时间获得结果。并且 FQ-PCR 可对感染的细菌进行定量分析，有助于了解细菌载量与疾病的关系。亦可通过特异片段设计引物及探针，对 Hp 进行分型诊断。 6 根除幽门螺杆菌的治疗方法 Hp 是慢性胃窦炎、消化性溃疡、胃黏膜相关性淋巴组织样瘤的主要致病因素，与胃黏膜萎缩，肠化生及不典型增生或胃癌明显相关，是一个重要的胃癌形成启动因素。文献报道消化性溃疡患者 Hp 感染率达 80%100%，根除 Hp 可明显减少溃疡的复发。理想的治疗方案应符合有效、简便、经济和安全的标准，Hp 的根除率按试验方案(per protocol，PP) 分析90%、按治疗意图（inte
37、ntion-treat,TT）分析80%，被推荐为可接受的 Hp 感染的治疗方案。治疗首选一线方案，如失败就改用二线方案，再失败则根据药敏试验调整方案或做具体分析。 以下是被大多数共识会议所推荐的治疗方案：标准剂量质子泵抑制剂（PPI）或雷尼替丁枸橼酸铋（RBC ）+克拉霉素 500 mg+阿莫西林 1 000 mg，均 3 次/ 日，治疗 7 日；标准剂量 PPI 或雷尼替丁枸橼酸铋（ RBC）+ 克拉霉素 500 mg +甲硝唑 400 mg，均 3 次/日，治疗 7 日；标准剂量 PPI+阿莫西林 1 000 mg +甲硝唑 400 mg，均 2 次/日，治疗 7 日；胶体铋剂标准剂量
38、4 次/日+甲硝唑 400 mg 2 次/日+四环素 500 mg 4 次/日，治疗 14 日；标准剂量 PPI 2 次/日 +胶体铋剂标准剂量 4 次/ 日+甲硝唑 400 mg 2 次/日+ 四环素 500 mg 4 次/日，治疗 14 日。推荐的 PPI 标准剂量为奥美拉唑 20 mg、潘妥拉唑 40 mg、埃索美拉唑 20 mg、兰索拉唑 30 mg、雷贝拉唑 10 mg；雷尼替丁枸橼酸铋标准剂量国外为 400 mg，我国为 350 mg；胶体铋剂标准剂量国外为 120 mg，我国为 110 mg。通常含阿莫西林的方案比含甲硝唑的方案更为优选，尤其是当甲硝唑耐药30%时。如果无法得到克
39、拉霉素，则推荐方案或，尽管平均根除率比含克拉霉素方案的根除率减小 10%。方案主要用于治疗失败者。 Maastricht 2-2 000 共识推荐以上方案和为一线治疗，其中 PPI 中雷贝拉唑的剂量推荐为 20 mg 2 次/日。方案为二线治疗，若无铋剂，则二线治疗应采用包括 PPI 的三联疗法。 7 幽门螺杆菌疫苗 Hp 是寄居于胃黏膜的人类最常见的病原菌之一，危害大，抗生素的治疗存在缺陷(高费用、耐药等)，故早在 20 世纪 90 年代初，有几个国外实验室开始进行口服接种 Hp 疫苗防治其感染的研究，至今已投入了大量的人力、物力。尽管至今尚未弄清人类既然能产生对 Hp 的慢性感染非特异性和
40、特异性免疫反应，但在自然感染条件下极少能产生清除 Hp 的免疫机制。然而，目前已研究出一些在动物模型甚至期临床试验行之有效的疫苗。 7.1 基于 Hp 整菌抗原的疫苗 首先由 Czinn 和 Nedracd 用 Hp 的整菌粗制抗原加 CT(霍乱毒素) 佐剂口服接种小鼠与雪貂后诱发动物产生高浓度的局部黏膜 IgA 反应，这提示整菌具有免疫原性。此后许多学者开展这方面的动物性研究，但结果参差不齐。也有学者用整菌抗原进行期临床试验，如 KarenL 等研究结果表明：Hp 整菌疫苗不能清除 Hp，只能增强人体对 Hp 的全身和局部黏膜免疫反应，且存在较为明显的不良反应(在 25 名自愿者中出现 6
41、名腹泻，5 名发热，2 名呕吐) 。总之，目前认为整菌抗原存在制剂粗糙，成本高，难以标准化，安全性差，且 Hp 呈多态性不能确定有效成分等缺点。故对 Hp 的各种抗原成分的研制已成热点。 7.2 基于尿素酶及其亚单位抗原的疫苗 尿素酶被认为是 Hp 不可少的定植因子，它在致胃炎型螺杆菌属中具有高度保守性。它暴露于细胞膜表面，占整个细胞重量的 6%，尿素酶 B 亚单位中 19 个氨基酸残基(UB33，位于氨基酸残基 3212339 间)，能特异地被抗体认别，进一步剔除氨基酸残基获得最小表位为 8 个氨基酸残基，研究者并用这两肽链制成抗原接种兔子获得抗尿素酶抗体，能抑制酶活性。这可能为寻找新的抗原
42、提供了方法。也有人用基因工程技术构建表达 Hp 尿素酶的活沙门氏伤寒杆菌(Ty21a) 口服接种 9 名志愿者，其研究结果表明：均无严重不良反应，虽产生弱的抗 Hp 尿素酶 T 细胞反应，但无体液免疫反应。总之，尿素酶及其亚单位抗原的研究结果存在诸多问题：它不能完全保护人类免受 Hp 感染，不同菌株的尿素酶抗原性不同，一般需佐剂；临床试验结果存在矛盾；对其安全性尚未作出评价等，这与临床试验例数过少，没有标准化疫苗制作程序以及菌株的多态性等有关，有待深入研究。 7.3 基于中性粒细胞激活蛋白(NAP)的疫苗 HP-NAP 能增强中性粒细胞 CD11b/CD18，后者可促进细胞间黏附分子表达增强，
43、使中性粒细胞黏附血管内皮细胞逸出血管壁移向感染部位，有利于清除 Hp 但也能损伤上皮细胞。目前认为强烈中性粒细胞反应是 Hp 感染引起胃黏膜组织损伤的重要致病机制，NAP 已被人们选为候选疫苗，能产一定的免疫保护作用。如Dundon 等对其结构和特性研究表明：HP-NAP 是由相同 172 kD 的亚单位组成，它能诱发中性粒细胞产生反应氧活性物，也显示对中性粒细胞和单核细胞和趋化作用，通过单核细胞能刺激组织因子和血浆酶原激活因子抑制因子 22 的产生。同样 Satin 等的研究表明：它能使人类产生抗 Hp 感染免疫应答的主要抗原；具有淋巴细胞的趋化因子作用；能口服接种诱发小鼠产生对 Hp 的保
44、护作用；能激活人类白细胞的 NADPH 氧化酶。目前其安全性及在人体上防治效果均未得到证实。 7.4 基于热休克蛋白(Hsp)的疫苗 目前认识到 Hsp 能提高 Hp 在恶劣环境中生存力，其中 HspA 属于 Gr0ES 蛋白 (分子伴侣素家族的辅助因子 )；作用机制复杂，能与尿素酶协同作用，故它引起了人们的重视。如 Todorob 等构建能表达 HspA 和 HspB 的 DNA 疫苗对鼠进行研究，结果表明：接种 3 个月后，血清特异性抗体升高，HspA 以 IgG2a 为主，而 HspB 为 IgG1/IgG2a，均能抑制 Hp 的定植和明显减轻胃炎程度。同理，LiMF 等利用基因工程技术
45、构建能表达 HspA 和 CTxB(即 CT 的亚单位)的融合蛋白活大肠杆菌 (BL221)，经口服接种于小鼠的试验其结果表明：CTxB 能增加胃肠道对 HspA 的吸收。这提示基因工程疫苗能作为候选疫苗。但是人们发现 H. pylori 与人自身的 Hsp 具有同源性，有可能诱发自身免疫性病。故从安全角度考虑，运用临床需慎行。 7.5 基于过氧化氢酶(katA)的疫苗 KatA，四聚体，分子量约为 200 kD，每亚单位为 50 kD，它主要与过氧化物歧化酶(SOD)协同作用保护 Hp 免受中性粒细胞杀伤。Hazell 等体外研究显示 KatA 可以阻止长链饱和脂肪酸形成毒性过氧化物对 Hp
46、 的杀伤作用。Liao 等用转基因技术构造能表达 KatA 的减毒伤寒杆菌 SL3261 菌株经口接种 C57/BL6 鼠,能产生免受 Hp 感染的作用。同理 Miyashita 等用编码 Hp katA 基因工程疫苗，经鼻腔内和皮内两条途径接种 C57/BL6 鼠后均能产生特异性抗IgG，明显抑制 Hp 的定植和减轻胃部炎症。在鼠 Hp 模型中用 KatA 加 CT 能产生 90%的保护作用。总之，过氧化氢酶作为疫苗抗原的研究需不断深入、扩大以及必要的临床试验来证实其疗效及安全性。 7.6 基于 Hp CagA、VacA 及其他抗原成分的疫苗 目前对 CagA、VacA 的研究较为深入，其分
47、子量、结构以及致病机制均较为清楚，其致病机制可能为：影响 H+2K+ATP 酶的话性；对胃黏膜的增殖和迁移产生影响；可诱发机体细胞因子表达，使炎症细胞聚集。Ghiara 等在鼠 Hp(驯化株)模型研究中发现，单独用 CagA 或 VacA 加 LTK63 (不耐热大肠杆菌毒素的突变体)免疫小鼠后分别获得对 Hp 感染 70%与 92%清除率，且能维持 3 个月保护作用。有人用纯化的 Va2cA 作疫苗能保护鼠免受 Tox + (产毒菌株)的 Hp 感染。但未发现能保护动物免受 Tox-(不产毒菌株)感染。因其毒性较强，存在潜在致癌性、保护范围较窄，故作疫苗抗原存在局限性，但用作多价疫苗中抗原成
48、分可能有利于提高疗效。此外，还有许多其他抗原如 Lpp20 (脂蛋白 20)被人开发出，在 Hp 动物模型中获得满意疗效，且无需尿素酶及 Hsp。还有脂蛋白、脂多糖、Lewis 抗原、黏附素等均具抗原性，均有希望成为疫苗抗原成份，有待进一步研究。 7.7 展望 随着免疫学基础研究的深入、Hp I 期临床试验的扩大，有利于发现和解决 Hp 疫苗中存在问题：如单价疫苗防治效果不完善，提示宜采用多价疫苗，如 Ferrero 等报告联用 HspB+尿素酶 B 亚单位经口接种鼠后获得 100%对 Hp 感染的保护，而仅用 Hp 粉碎物为 94%；寻求安全有效的免疫途径；有人用一种疫苗接种不同种属鼠的结果
49、提示无论是预防还是治疗，均有明显差别，表明疫苗需个体化；开发新型基因工程疫苗有利于加快疫苗研发；同时加强对佐剂研究。加之人们对安全性问题的认识不断深入，这些均为疫苗的研发创造条件。在动物模型的研究方面，现已有人提出通过转基因、基因剔除、重组动物可能有利于优化疫苗研究。 参考文献 1 Tomb JF，White O，Kerlavage AR，et al. Venter JC The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori . Nature，1997，388: 539-547. 2 朱庆义 . 幽门螺杆菌毒力岛及其病原性研究进展.临床检验杂志，2002，(20):74-76. 3 Moss SF，Sordillo EM，Abdalla AM，et al. Increased gastric epithelial cell apoptosis associated with colon
