1、牛奶中蛋白质含量的测定,凯氏定氮法,3,1,2,4,内容,7,5,内容,4,1、实验目的与要求（1）掌握半微量凯氏定氮法的原理。（2）熟悉利用半微量凯氏定氮法测定干酵母片中蛋白质含量的操作方法。,2、实验原理,蛋白质是含一定量氮的有机化合物，蛋白质样品在凯氏烧瓶中经过浓H2SO4消化后，有机物炭化生成碳，碳将硫酸还原为SO2，本身则变成CO2，SO2使N还原为NH3，本身则氧化为S2O3而消化过程中生成H2，又加速了NH3的形成。在反应过程中，生成的H2O和S2O3溢出，而NH3则与H2SO4结合成（NH4）2SO4存在溶液中，加入NaOH,并蒸馏，使NH3溢出，用H3PO3吸收后，以标 准酸
2、溶液滴定，根据标准酸溶液消耗的量计 算样品中的含氮量，从而可以折算出蛋白质含量。,3、所能使用的方法（1）凯氏定氮法凯氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，经过研究人员的长期不断改进，到目前为止已演变成常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种方法，至今仍被作为标准检验方法。,（2）分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。,4、适用范围凯氏定氮法可用于所有动植物食品的蛋白质含量测定，不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的视频测定。,5、所用仪器和药品,（1） 仪器消化管、小漏斗、研钵、玻璃
3、珠、酸式滴定管、 锥形瓶、天平、凯氏定氮仪、定氮瓶等。（2） 药品奶粉试样；硫酸铜、硫酸钾接触剂；浓硫酸；,过氧化氢；碳酸钠试样；氢氧化钠；水；硼酸；甲基红指示剂。,6、实验步骤,（1） 样品消化a、奶粉称取0.2-2.00g置于消化瓶中，加入硫酸铜、硫酸钾接触剂3g，7滴过氧化氢，并沿烧瓶壁缓缓加入20 mL浓硫酸，加入玻璃珠23粒，摇动烧瓶使全部样品浸没于硫酸。b、消化管放在消化炉支架上，倾斜45度角斜支于有小孔的石棉网上。c、把支架连同装有试样的消化管一起移至电,热炉上保持消化管在电炉中心，设定温度在420 保持消化管中液体连续沸腾，沸酸在瓶颈部下冷凝回流。待溶液消煮至无微小碳粒、呈蓝绿
4、色时继续消煮5 min左右。d、消化结束，将支架连同消化管一同移回消化管托底上，冷却至室温。注意，在冷却过程中，毒气罩必须保持吸气状态（切忌放入冷水中冷却）放置，防止废气溢出。,（2）样品蒸馏,a、打开自来水给水龙头，使自来水经过给水口进入冷凝管。注意水流量以保证冷凝管起到冷却作用为止。c、在蒸馏导出管托架上，放上已经加入适量（15 mL左右）的接受液（硼酸和混合指示剂）的 锥形瓶。抬起锥形瓶支架使蒸馏导出管的末端浸入接受液内。,d、在消化完全冷却后的消化管内，逐个加入10 mL左右蒸馏水稀释样品，再加入10ml氢氧化钠。e、检查好气密性后，就进行加热蒸馏，蒸馏至接收瓶中液体从暗红变为绿色后再
5、加热5分钟后即可。f、等反映完全后，取下接收瓶，将溶液倒入锥形瓶中用配置好的盐酸标准溶液滴定至终点。,g、平均测定三组数据，记录下所有数据。7、数据处理（1）盐酸标准溶液标定,即盐酸标准溶液浓度为：,用盐酸标准溶液滴定接受瓶中的溶液：,计算公式：,X-试样中蛋白质的含量，g/100g或g/100ml; v-式样消耗盐酸标准滴定液的体积，ml; c-盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L;,0.0140-1.0盐酸标准滴定溶液c(1/2HCl)=0.0500mol/L相当于氮的质量，g/mmol; m-试样的质量（或体积），g或mL； F-氮换算为蛋白质的系数，不同种类的食品系数不同。,即：,所测得奶
6、粉中蛋白质的含量平均为32.4g/100g,8、实验讨论,（1）蒸馏反应室里的溶液总体积要控制，否则反应室溶液体积太大，液面升高，容易喷进冷凝管内。还要控制蒸汽量或火力大小，蒸汽量太大也会将反应液喷进冷凝管中；火力太小，蒸馏速度慢，且易发倒流；蒸汽产生要均匀，防止暴沸；一定要装上蒸汽发生器的安全管，同时加上几粒玻璃珠。（2）本实验方法要求实验样品应是均匀的，大块的固体样品应用粉碎设备打得细小均匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。,（3）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。（4）消化过程中，首先确保浓硫酸量足够，如样品脂肪含量较高时，应适当增加硫酸量;其次对某些样品炭化易产生泡沫，这时可采用消解炉曲线升温或手动控制升温，让消解溶液沸腾均匀后再提高消解温度，直至消化液呈透明蓝绿色再消化0.5h或1h。因为炭化过程中，升温速度过快会使样品溢出消化管或溅起粘附在管壁导致无法消化完全而造成氮损失，影响结果准确性。,（5）蒸馏时必须加碱，一是中和硫酸，二是使溶液处于强碱性，这样才能使 (NH4)2SO4变成NH3被硼酸吸收。,Thanks!,
