1、第三章 培养基,第一节 培养基的类型 第二节 培养基的成分及来源,第一节 培养基的类型,1、按培养基成分,1）合成培养基, 所用原料的化学成分明确、稳定 如葡萄糖、硫酸铵 适于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作；在生产某些疫苗的过程中，为了防止异性蛋白质等杂质掺入，也常用合成培养基； 营养单一、价格较高，不适于大规模生产,2）天然培养基, 原料是一些天然动、植物产品 如花生饼粉、蛋白胨等 来源广泛（大多为农副产品）、营养丰富、价格低廉、适于工业化生产 一般不需要另加微量元素、维生素等物质 由于成分复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,2、按物理状态分,1）固体,
2、适于菌种和孢子的培养与保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产； 近年来由于机械化程度的提高，在发酵工业上又开始应用固体培养基进行大规模生产，其组分常用麸皮、大米、小米、木屑、禾壳等。,2）半固体, 琼脂0.5%-0.8% 主用于鉴定细菌、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等,3）液体,发酵工业大规模使用的培养基,3、按用途分,供菌种繁殖孢子的培养基，常用固体培养基。,1）孢子培养基,孢子培养基基本要求：,配制时需注意： A）营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。 如灰色链霉菌在葡萄糖-硝酸盐-其他盐的培养基上都能很好地生长和产生孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋
3、白后，就只长菌体而不产孢子B）所用无机盐的浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色。C）注意pH和培养基的湿度。,基本要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子，且不易引起菌种发生变异。,常用孢子培养基：, 麸皮培养基 小米培养基 大米培养基 玉米碎屑培养基 用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基,大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少、疏松、表面积大，是良好的孢子培养基。,2）种子培养基,供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基。, 营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。, 种子培养基的成分要考虑在
4、代谢过程中能维持稳定的pH，其成分还要根据不同菌种的主要特征而定。, 一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利菌体的迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机氮源和无机氮源。, 最后一级的种子培养基的成分最好能较接近于发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。,3）发酵培养基, 既要使种子接入后能迅速生长，达到一定的菌体浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等。,供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。, 但
5、若因生长和合成产物所需的总的碳源、氮源和其他营养物质总的浓度太高，或生长和合成产物两个阶段各需的最佳条件有求不同时，则可考虑培养基用分批补料工艺来加以满足。,第二节 培养基的成分及来源,一、碳源,主要功能：1）为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的成分； 2）为合成目的产物提供所需的碳素成分,常用的碳源:,特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解物或氨基酸等也可被微生物作为碳源使用。,1、糖类, 发酵培养基中使用最广泛的碳源; 主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等,工业上常用的糖类及来源,淀粉水解糖的制备是发酵生产的一项重要工艺。,葡萄糖 最易利用，几乎所有微生物都能利用 葡萄糖常作为培养基的一种
6、主要成分，并且作为加速微生物生长的一种有效糖。 但过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物（如丙酮酸、乳酸、乙酸等）不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。,糖蜜 制糖的结晶母液，它是制糖工业的副产物; 含有丰富的糖、氮类化合物、无机盐和维生素等，是微生物发酵培养基价廉物美的碳源; 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%-75%。 糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，二者在糖的含量和无机盐的含量上有所不同，即使同一种糖蜜由于加工方法不同其成分也存在差异，因此使用时要注意。,淀粉糊精 多糖，也是常用的碳源;
7、 需经胞外酶水解成单糖后再被吸收利用; 使用淀粉可克服葡萄糖代谢过快的弊病，价格也比较低廉，在发酵工业中被普遍使用。 常用的淀粉为玉米、甘薯、马铃薯、木薯淀粉。, 油和脂肪也能被许多微生物作为碳源和能源 这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成CO2和H2O，并释放出大量的能量。 当微生物利用脂肪作为碳源时，要供给比糖代谢更多的氧，不然大量的脂肪酸和代谢中的有机酸会积累，从而引起pH的下降，并影响微生物酶系统的作用。 常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等,2、油和脂肪, 一些微生物对多种有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙
8、酸等）有很强的氧化能力，可以有机酸或有机酸盐作为碳源。 有机酸的利用常会使pH上升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱性物质的产生，使pH进一步上升。如以醋酸盐为碳源时，反应如下： CH3COONa + 2O2 2CO2 + H2O + NaOH,3、有机酸, 随着石油工业的发展，微生物工业的碳源也有所扩大。 正烷烃（一般指从石油裂解中得到的14-18碳的直链烷烃混合物）已用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工业发酵中。 石油工业的发展促使乙醇产量的增加，乙醇代粮发酵的工艺发展也十分迅速，自然界中能同化乙醇的微生物和能同化糖质的微生物一样普遍，种类也相当多，乙醇作碳源其菌体得率比葡萄糖作
9、碳源还高，因而乙醇已成功地应用于发酵工业的许多领域中，如利用乙醇生产单细胞蛋白,4、烃和醇类,二、氮源,有机氮源 豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等,无机氮源铵盐、硝酸盐等（由于细胞内的含氮物质都以氨基或亚氨基的形式存在，故铵态氮可以直接用于合成细胞物质；而硝态氮需还原成氨后才能被利用）,无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用，为速效氮；蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用， 属迟效氮, 氮源物质常对培养液pH产生影响(NH4)SO4 2NH3 + H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH反应中所产生的NH3被菌体作为氮源利用后，
10、培养液中就留下了酸性或碱性物质。 在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液的pH下降，为生理酸性物质； 硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性物质,三、无机盐和微量元素, 磷酸盐,磷是某些蛋白质和核酸的组成成分 磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用 微生物对磷的需要量一般为0.0050.01mol/L 常用K3PO4、Na2HPO4 、NaH2PO4, 硫酸镁,Mg 2+是许多重要酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂 镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身所产的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌。硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分
11、 硫是构成一些酶的活性基 硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。, 钾盐,钾不参与细胞结构物质的组成 是许多酶的激活剂 菌体生长所需钾量约为0.1g/L(以K2SO4计), 微量元素,需量微少，但又不可缺少 一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，不必另加 某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的毒性,四、生长因子,概念： 微生物生长不可缺少的微量有机物质。,类别： 维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物,不是所有微生物都必需的，只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物质。, 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为
12、生长因子。 又如目前所使用的赖氨酸产生菌几乎都是谷氨酸产生菌的各种突变株，均为生物素缺陷型，同时也是某些氨基酸如高丝氨酸的缺陷型，需要生物素和某些氨基酸作为生长因子。,提供生长因子的农副产品原料,1）玉米浆（ corn steep liquor, CSL）, 用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副产品, 虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。,2）麸皮水解液,可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。,用量一般为1%（以干麸皮计）左右,水解条件： 以干麸皮：水：HCl=4.6:26:1配比混合，装入水解锅中以0.
13、070.08MPa表压加热水解7080min。 以干麸皮：水=1：20，用盐酸调pH值1.0，以0.25MPa表压加热水解20min。然后过滤取滤液。,3）糖蜜（molasses）, 甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低 甘蔗糖蜜用量为0.1%0.4%,4) 酵母,酵母膏、酵母浸出液、酵母粉,5）其他,牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子,五、水,生理功能： 1）是微生物机体的重要组成部分 2）进行代谢反应的介质 3）营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后才能通过细胞表面进行正常的活动； 4）水的比热高，能有效吸收代谢过程中放出的热，使细胞内温度不致骤
14、然上升；同时水又是热的良导体，有利于散热，可调节细胞温度。, 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大，特别是水中的矿物质组成对酿酒工业和淀粉糖化影响甚大。 水源质量的主要参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,六、前体 (precursor),概念： 指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而又较大的提高。,发现： 最早是从青霉素的生产中被发现的。 加入玉米浆后，青霉素单位可从20U/ml增加到100U/ml；
15、玉米浆中含有苯乙胺，它能被优先合成到青霉素分子中，从而提高青霉素G的产量。,大多数前体，如苯乙酸对微生物的生长有毒性，以及菌体具有将前体氧化分解的能力，因此在生产中为了减少毒性和增加前体的利用率，常采用少量多次的流加工艺。,七、促进剂和抑制剂,1、促进剂：促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。, 促进剂不是前体或营养物 可影响正常代谢，或促进中间代谢产物的积累，或提高次级代谢产物的产量,例如 巴比妥可增加链霉素产生菌的抗自溶能力，推迟自溶时间，增加链霉素积累。 谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，加入红霉素可提高产量25%以上。,各种促进剂对产酶的促进作用, 促
16、进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。, 各种促进剂的效果除受菌种、菌龄的影响外，还与所用的培养基组成有关，即使是同一种促进剂，用同一菌株，生产同一产物，在使用不同的培养基时效果也会不一样。,如在酶制剂生产中，有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或鳌合有害的金属离子。,2、抑制剂抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。,如酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，可以使酒精发酵受到抑制，而转入甘油发酵,某些代谢产物的抑制剂,
