1、海 南 大 学期 末 考 试 论 文科 目： 蛋白质工程 题 目：聚乙二醇修饰在蛋白药物领域的研究进展学 号： 200904123100* 姓 名： 郭冬阳 学 院： 材料与化工学院 系 别： 生物工程系 专 业： 生物工程 指导教师： 唐敏 完成日期： 2012 年 12 月 29 日聚乙二醇修饰在蛋白药物领域的研究进展摘要随着科学家对蛋白质工程技术的深入研究，聚乙二醇修饰技术已经成为改良蛋白药物最有效的技术之一，得到越来越广泛的应用。鉴于聚乙二醇本身的特性与蛋白质结构的复杂性，如何使它更好的修饰蛋白并对其修饰位点进行分析鉴定成为科学研究的重点与难点。本文主要简述就 PEG 定点修饰的技术和
2、PEG 修饰位点的分析检测方法，并展望了 PEG 修饰技术未来的发展趋势。关键词：聚乙二醇；蛋白质药物；结构；蛋白质工程；修饰位点一、 蛋白质药物的聚乙二醇修饰简介药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上是一种蛋白质工程分子修饰方法。药物的聚乙二醇修饰可分为两个阶段。第一阶段的修饰技术局限于应用相对分子质量低的单甲氧基聚乙二醇(20000)聚乙二醇修饰剂为特征的第二阶段的修饰技术具有连接稳定、定点修饰、控释等特点,修饰后的药物具有更高的生物活性、更好的物理及热稳定性、更高的产品均一性和纯度。但总得说来,蛋白药物 PEG 修饰技术中
3、最大的问题就是无法实现定点修饰 ,修饰产物不均一,给分离纯化带来很大难度,也很大程度上阻碍了临床应用。根据蛋白质的氨基酸性质和 PEG 衍生物的特点,科研人员开发了多种定点修饰的策略和方法。1.1 修饰氨基多肽蛋白质分子参与 PEG 化反应的基团常为 -和 -氨基,因此用于修饰氨基的单甲氧基聚乙二醇衍生物(mPEGs)种类较多 ,可分为烷基化 mPEGs 和酰基化 mPEGs 两大类。烷基化 mPEGs,包括 mPEG-醛、 mPEG-三氟乙磺酸及mPEG-环氧化物等。其中 mPEG-醛的修饰条件温和,交联时不引入其他活性基团,在低 pH 下仅修饰 N-末端氨基,对活性影响较小,同时方便产物的
4、纯化和鉴定,已用于 G-CSF、IFN 及 CD4-IgG 等的修饰。mPEG-三氟乙磺酸的修饰条件也较温和 ,对 GM-CSF 修饰后使其保持较好活性。 mPEG-环氧化物虽制备简单 ,但偶联物含活性羟基,易发生其他交联反应,修饰率也较低。酰基化 mPEGs,包括 mPEG-琥珀酰亚胺酯和 mPEG-苯并三唑碳酸酯,这两种修饰剂可优先与赖氨酸残基反应,也可与组氨酸和酪氨酸残基反应。此外,mPEG-硝基苯碳酸酯、mPEG-三氯苯碳酸酯及 mPEG-氧羰基咪唑比前述两种反应活性低,但修饰专一性较好。1.2 基于氨基保护的定点修饰对于蛋白中含有多个修饰位点,可以利用氨基保护试剂对修饰后会导致蛋白失
5、活严重的位点实施保护,对活性高的修饰位点进行定点修饰后,再将保护试剂去除。Youn 等研究发现生长激素释放因子(GRF)由于蛋白水解和肾小球过滤作用,其在体内的半衰期非常短,无法有效发挥药效,因此选择 PEG 修饰技术解决这些问题。但是在该蛋白序列上,有 3 个修饰位点(Try1,Lys12 和 Lys21),其中修饰第21 位赖氨酸的氨基可以使蛋白保持最高的生物活性,因此,将 1 位 Try 和 12 位Lys 的氨基进行 92 芴甲氧羰基(FMOC)修饰保护后 ,用活化 mPEG 修饰 21 位 Lys获得定点修饰蛋白,然后再将 FMOC 去除。这样既能保持生物活性,又能获得半衰期长,稳定
6、的蛋白药物。1.3 修饰羧基有一些蛋白的 N 端对其生物活性起着重要作用,如果在 N 端实施 PEG 修饰则会使蛋白的生物活性丧失,因此将 PEG 修饰的位点转移至 C 端则是一种有效的修饰策略。一般选用 mPEG-酰肼或 mPEG-胺对蛋白质进行修饰,羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。mPEG-酰肼是近年来开发的又一种可与羧基特异性结合的修饰剂。1.4 修饰巯基与赖氨酸相比,半胱氨酸在蛋白质中出现几率和数量很少,利用具有巯基反应活性 PEG 衍生物就可以实现蛋白定点修饰,但缺点是半胱氨酸的巯基通常处于蛋白的活性中心,修饰后会使蛋白活性损失较大。对于没有半胱氨酸的蛋白则可以通过基因
7、工程手段引入巯基反应位点。这一方法不但能够实现高度选择性修饰,而且能够减少蛋白生物活性的丧失,并降低免疫原性。目前可用于巯基修饰的 mPEGs 包括 mPEG-马来酰亚胺、mPEG-邻吡啶-二硫醚、mPEG-乙烯基砜及 mPEG-碘乙酰胺等。其中 mPEG-马来酰亚胺制备简单,应用较多。PEG-邻吡啶-二硫醚与蛋白质偶联形成的 SS 键,在生理条件下可缓慢水解,释放出天然蛋白质,有利于活性的恢复,但修饰率低。PEG- 乙烯基砜在 pH7-9 范围内可选择性的与巯基反应,当 pH 较高时则与氨基交联。 PEG-碘乙酰胺的优势在于经强酸水解后,可释放出半胱氨酸衍生物,易于鉴定。1.5 二硫键定点修
8、饰 对蛋白中含有的二硫键进行 PEG 定点修饰分为 2 个步骤: 首先利用温和的还原剂使二硫键还原释放两个硫氢基;第二步通过 PEG 修饰剂的双烷基化反应重建二硫键,从而完成 PEG 的定点修饰。在修饰蛋白过程中不会出现蛋白的不可逆变性,而且二硫键还原后蛋白仍维持其三级结构,PEG 选择性的修饰两个硫基,PEG 的立体屏障作用确保 1 个二硫键只结合 1 分子 PEG。但是二硫键 PEG修饰可能会由于 PEG 的屏蔽作用,降低蛋白的生物活性。 Veronese 等利用变性剂盐酸胍(3mol/L) 使蛋白部分变性,高级结构打开,但不使用还原剂以保护二硫键,在非折叠状态下完成 PEG 修饰后,通过
9、透析或凝胶过滤色谱的方法去除变性剂 ,使蛋白重新正确折叠恢复生物活性。1.6 非极性氨基酸定点修饰 通常只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行 PEG 化学修饰。Deiters 等开发了一种定点修饰非极性氨基酸苯丙氨酸的方法,首先用叠氮化物通过亲核取代反应修饰蛋白质中的苯丙氨酸生成对位叠氮化苯丙氨酸,再用炔烃衍生的 PEG-酰胺修饰剂修饰苯丙氨酸,发生环化加成反应形成稳定的连接体 ,从而完成对蛋白的定点修饰。另外,通过基因重组在蛋白质中引入含叠氮基团的氨基酸残基,再与特定 PEG 修饰剂偶联形成稳定的定点单修饰产物。 Cazalis 通过基因工程方法在血栓调节蛋白(Thrombomodu
10、lin) 的 C 端引入叠氮蛋氨酸,与 mPEG2三芳基膦(mPEG2triarylphosphine)修饰剂生成稳定的单修饰物,尽管该方法比较复杂,但至少给我们提供了一个新的 PEG 修饰蛋白的思路。1.7 糖蛋白中糖基定点修饰 此类 PEG 定点修饰的原理是:首先用葡萄糖氧化酶或高磺酸钠氧化糖类残基产生具有反应活性的醛基,这些醛基可与 mPEG2 肼衍生物反应生成腙或与mPEG2 胺衍生物反应生成可逆的 Schiff 碱。用硼氢甲腈钠可将腙还原为更稳定的烷基肼化物,而 Schiff 碱可以还原为仲胺。相对于 mPEG-胺衍生物修饰,PEG-肼衍生物修饰不会形成交联聚合体,更适合于糖基的修饰
11、,最有代表性的 mPEG2肼衍生物是 mPEG2 酰肼(hydrazide2mPEG) 。酰肼基团极低的 pKa 值使得酰肼基团在酸性环境下(pH4.55.0)中仍可以和羧基结合 ,而蛋白质中的氨基在该条件下由于发生质子化而不能与羧基反应,从而可实现选择性定位修饰。由于蛋白种类多样和结构复杂,往往会使得 PEG 修饰反应特异性不强 ,反应条件要通过大量试验优化。如果能够利用计算机技术对蛋白质晶体结构表面性质进行理论计算和分析,确定可能的反应位点和基团,并根据被修饰基团与修饰剂的结构特点设计合适的连接物,这样不但可以减少 PEG 修饰的盲目性,而且能够提高研究效率。胡远东等利用 Insight分
12、子模拟软件包(BiosymInc.,SanDiego,CA)对牛血红蛋白晶体(bHb)进行了结构分析和分子模拟,计算了蛋白表面 24 个可进行 PEG 修饰的 Lys 残基及其主要原子的溶剂可及表面积,确定了其中可以进行修饰的 13 个 Lys 残基(溶剂可及表面积0.4nm2),并进一步设计了具有双功能基团的小分子化合物环氧乙烷基活化 PEG 作为连接体。结果表明,PEG 修饰的 bHb 的携氧能力和免疫原性等生物学指标均达到预期结果。二、 聚乙二醇的修饰位点鉴定蛋白质类药物 PEG 化位点鉴定的一般方法是以天然蛋白质作对照 ,用蛋白酶(如胰蛋白酶) 水解,由缺失的肽片段来推断 PEG 化位
13、点。但该方法存在一定缺陷,易出现鉴定误差。VeroneseFM 等采用一种新的 PEG 衍生物,可解决鉴定差的问题,即用经琥珀酰亚胺酯活化的氨基酸(Met-Nle 或 Met-Ala)作为连接键,偶联物经 BrCN 裂解可得到与 Nle 或 -Ala 相连的蛋白质经常规分析(如氨基酸分析、Edman 降解法 )可以确定 Nle 或 -Ala 连接位点,进而确定 PEG 化位点。质谱法质谱法是测定物质结构的重要手段。VestlingMM 等对 PEG 修饰后的超氧化物歧化酶(SOD)进行水解,采用串联质谱(tandeMS)测定其肽图,以判断修饰位点及修饰程度。三、 聚乙二醇修饰技术的前景展望自从
14、 20 世纪 70 年代以来,已有十余种 PEG 修饰的蛋白药物上市 ,，表现出优良的临床效果，还有 PEG-水蛭素等多种药物正处于临床实验阶段针。但仍有许多蛋白药物由于常规的多点修饰不能得到理想的效果,因此随着 PEG 修饰蛋白技术研究的不断深入,已从原来的多点随机修饰向定点单修饰发展,由复杂的多单元操作向便捷高效的集成操作发展,提高了修饰蛋白的生物活性,降低了 PEG修饰的成本,扩大了 PEG 修饰技术的应用范围。鉴于蛋白质类药物本省的理化特性,只有根据其不同性质综合考虑，选择合适的 PEG 修饰技术才能起到良好的效果。对不同的酶多肽或蛋白选择适宜的 PEG 活化和偶联方式以及相应的产物分
15、离与结构分析检测的各种方法都有其适用范围和局限性至今还没有通用的方法可供选择。对被修饰蛋白的修饰度及结构的测定仍是该类产品开发的核心与难点。随着 PEG 修饰技术和分析技术的研究的不断深入，先进仪器的出现以及不同检测方法的联合运用必将进一步提高聚乙二醇修饰蛋白质的特异性从而使产物的分离纯化和分析检测更加简单易行，这也是 PEG 修饰技术发展的必然要求。参考文献1董惠钧,姜俊云,郑立军.庞俊星蛋白药物聚乙二醇修饰技术研究进展中国生化药物杂志 J.2009,30(3):199-202.2秦海娜,修志龙.聚乙二醇修饰蛋白质的活化与检测方法 .化学通报J.2003,66:1-103张修建,王清明,陈惠
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