1、质粒 DNA 的提取与检测1 概述细菌质粒是一些双链、闭环的 DNA 分子，其大小范围从 1kb 至 2000kb 不等。已经存在形形色色的细菌类群中发现质粒，这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的遗传单位。然而，它们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。通常，质粒含有编码某些酶的基因，这些酶事实上在一定的环境下可能对细菌宿主有利。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等。质粒 DNA 的复制由负责复制细菌染色体的多种酶来完成，但是不同的质粒在宿主体内所采用的酶迥然不同，而且在宿主中复制的程度也相差悬殊。一些
2、质粒的拷贝数可高达700 个细胞，而另一些则只能维持在每套宿主细胞染色体仅对应 l 个质粒分子的最低水平上。控制质粒拷贝数的基因处于包括 DNA 复制起点在内的一个质粒 DNA 区域内。通常情况下，一个质粒只含有一个复制起始区（复制子） 。目前使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒的复制子。在正常生长条件下，每个细菌细胞中可维持至少 1520 个拷贝（带有该复制子的质粒） 。一般认为，这种多拷贝的质粒是以松弛方式进行复制的。pMB1 复制子的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半寿期较长的酶。因此，即使蛋白质合成并非正在进行，复制依然能够进行。这样，当抑制蛋白质合成
3、并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素存在时，带有 pMB1 复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可以积聚两三千个拷贝。单向复制从 DNA 复制起点开始，由一个 RNA 引物所引导，该引物的启动子位于复制起点上游大约 550bp 处。新生的 RNA 与 DNA 模板形成稳定的杂交体，作为 RNA 酶 H 的底物，由 RNA 酶 H 切割从而产生引导 DNA 合成的引物。而 RNA的成熟则由另一个不翻译的 RNA 小分子（RNA I）所控制。RNA I 编码 RNA的同一区段的 DNA 的互补链转录而来，它可与 RNA 结合，并阻止 RNA 折叠为三叶草结构，而三叶草结构对于形成稳定的
4、 DNA-RNA 杂交体又是必不可少的。一个只有 63 个氨基酸的小蛋白（Rop 蛋白）可以增强 RNA I 和 RNA 的结合，这一蛋白由位于复制起点下游 400 个核苷酸处的基因所编码。Rop 蛋白强化了 RNA I 对复制的负调节作用（图） 。图 带 pMB1 （或 ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录物的方向及其粗略大小因此，可削弱 RNA I 和 RNA 之间相互作用的突变，将会增加带有 pMB1 复制子的载体的拷贝数。 。这些突变位于 rop 基因区或编码 RNA I 和 RNA 的复制起点上游区内。例如,pUC 质粒之所以拷贝数较高，是因为在 RNA I 的正常起
5、始位点上游 1 个核苷酸的位置带有 G-A 突变，结果 RNA I 转录物的起始位点位于正常起始位点下游 3 个核苷酸的位置。RNA I 5-端的完整对于 RNA I 和 RNA 间的相互作用至关重要。因此，pUC 质粒拷贝数的增加看起来很可能是由缩短的 RNA I 和 RNA 结合效率降低所致。除了控制拷贝数以外，质粒上编码 RNA I、RNA 和 Rop 蛋白的区段也决定两个不同的质粒是否可以在同一个细菌细胞中共存。利用同一复制系统的不同质粒不能稳定地和平共处，可以称之为不相容质粒。当两个上述质粒被导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中会彼此竞争。由于质粒是从细胞内的质粒库中
6、随机选取出来进行复制的，所以两个不同的质粒在一个单细胞中的拷贝数并不是总能保持相同。最初在随机过程中产生的微小差异，将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重的失衡。在一些细胞中，一种质粒处于优势；而在另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒却占尽上风。细菌生长几代后，占少数的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可能含有两种质粒的任意一种，但不会兼而有之。在分子克隆的所有操作中最基本的或许要算核酸的分离纯化，分离纯化核酸总的原则是： 应保证核酸的一级结构完整性； 排除其他分子的污染。为了保证对核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构中。核酸的一级结构还决定其高级结
7、构的形式及其和其他大分子结构结合的方式。核酸的纯化方式应符合以下三个条件： 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其他生物大分子（如蛋白质、多糖和脂类分子）的污染应降低到最低程度； 排除其他核酸分子的污染，如提取 DNA 分子时，应去除 RNA 分子，反之亦然。为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事宜。 尽量简化操作步骤、缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。 减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在 pH410 的条件下进行。 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械
8、剪切力的主要危害对象是大分子量的线型 DNA 分子，如真核细胞的染色体 DNA ；对分子量小的环状 DNA 分子，如质粒 DNA 及 RNA 分子则威胁相对少一些。高温（如长时间的煮沸）对核酸的完整性有很大破坏，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，常规操作温度为 04 ，此温度环境可降低核酸酶的活性与降解反应速率，减少其对核酸的生物降解。 防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶会降解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA 酶需要二价金属离子 Mg2+、Ca 2+的激活，使用二价金属离子螯合剂 EDTA、柠檬酸盐基本上可以
9、抑制 DNA 酶的活性。不同的研究目的对 DNA 的纯度和量的要求不尽相同，一个好的 DNA 分离程序应符合以下三个主要标准。 所得的 DNA 的纯度应满足下游操作的要求，用于 RFLP 分析的DNA ，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行 Southern 杂交；用于 PCR 分析的 DNA 则不应含干扰 PCR 反应的污染物，PCR 过程对模板的要求不是很高，模板不需要达到超纯。大量的实验数据表明，存在一定量的蛋白质或 SDS 等对实验过程影响不大，所以只要没有交叉污染，模板 DNA 的制备可以不必像克隆、酶切、连接、标记等反应所用 DNA 的制备那样严格。但在
10、DNA 模板中，不能有影响扩增反应的物质存在。例如蛋白酶、核酸酶、结合 DNA 的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基磺酸钠、卟琳类物质等；还有一类是二价金属离子的螯合剂（如 EDTA 等） ，会与镁离子络合，影响 Taq DNA 聚合酶的活性。上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。 所得的 DNA 应当完整，电泳检查时应能得到精确性高、重复性好的迁移带型。 所得 DNA 应有足够的量。因此，核酸提取的主要步骤不外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取
11、的核酸分子的特点而定，然而一些核酸纯化和浓缩的基本方法都是一致的。核酸纯化的关键步骤是去除蛋白质，通常只要用苯酚氯仿和氯仿抽提核酸的水溶液即可。每当需要把克隆操作中的某一步所用的酶灭活或去除以便进行下一步操作时，即可进行这种抽提。然而，如果要从细胞裂解液等复杂的混合物中纯化核酸，则需要增加一些处理措施。这些情况下，通常先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质，然后再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白水解酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶 K 等，它们对多种天然蛋白均有活性。从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法是先用苯酚氯仿抽提，然后再用氯仿抽提，这是因为使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。此外，
12、苯酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全地抑制 RNA 酶的活性，而且它还能溶解带有长 poly ( A）的RNA 分子。使用苯酚氯仿异戊醇（2524 1）混合液可使这两个问题迎刃而解。然后再用氯仿抽提则可去除核酸制品中残留的痕量苯酚。应用最为广泛的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下形成的核酸沉淀物，可通过离心进行回收并按所需浓度重新溶解于适当的缓冲液中。这一技术不但快速，而且对含量极低（皮克级）的 DNA 和 RNA 也可定量回收。主要的可变因素包括以下三个。(l）形成沉淀的温度在 0 且没有载体存在的情况下，浓度低至 2Ong / mL 的 DNA 也能形成沉淀，用微量离心机
13、进行离心即可定量回收。( 2 ）在沉淀混合液中使用的单价阳离子的类型和浓度 常用于沉淀核酸的阳离子及其浓度表，其选择很大程度上取决于人们的习惯。表 常用于沉淀核酸的阳离子及其浓度提供阳离子的化合物 贮存液浓度/molL -1 终浓度/molL -1乙酸铵LiClNaCl乙酸钠10.08.05.03.02.02.50.80.20.3乙酸铵常用于减少 dNTP 的共沉淀。例如，在 2mol/L 乙酸铵存在下连续沉淀两次，可从 DNA 制品中除去 99 的 dNTP。但是，如果沉淀的核酸将要用于磷酸化则不能使用乙酸铵，因为铵离子会抑制 T4 噬菌体多核苷酸激酶的活性。若用较高浓度的乙醇沉淀核酸，例如
14、在沉淀 RNA 时，常用 LiCl 。LiCl 在乙醇溶液中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。如果沉淀的 RNA 将用于无细胞翻译或反转录过程，则应避免使用 LiCl。在大多数无细胞体系中，氯离子可抑制蛋白质合成的起始，也抑制依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶活性。由于不同大小的 RNA 在高浓度 LiCl 中的溶解度各不相同，故 LiCl 可用于选择性地纯化大分子 RNA。含有 SDS 的 DNA 样品应使用 NaCl ( 0.2mol /L）进行沉淀，这时去污剂在 70的乙醇中仍保持可溶状态。DNA 和 RNA 的沉淀大多使用乙酸钠（ 0.3mol /L , pH5.2） 。（3） 离心的时
15、间与速度 在没有载体 DNA 的情况下，用微量离心机于 04以1200g 离心 15min，可定量回收含量低于 20ng /mL 的核酸。然而，处理更低浓度的 DNA或较短（少于 100 个核苷酸）的片断时，则应延长离心时间以使核酸沉淀紧贴于离心管上。用微量离心机离心以后，并非所有的 DNA 都聚集于管底，多达 50的 DNA 可附着于管壁上。要回收所有的 DNA，就必须要用液滴来回冲洗管壁的相应扇面。可使用 1 倍体积的异丙醇代替 2 倍体积的乙醇来沉淀 DNA，使用异丙醇的优点是待离心的体积较小。但是，异丙醇的挥发性比乙醇低，因而更难去除。此外，使用异丙醇时，蔗糖或氯化钠等溶质更容易与 D
16、NA 共沉淀。一般来说，乙醇沉淀更受青睐，只有必须尽量减少溶液体积时除外。提取质粒 DNA 有多种方法，所有这些方法都包括 3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒 DNA。可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解。经溶菌酶和 SDS 处理后，在碱性条件下，细菌染色体 DNA 和质粒 DNA 都变性，而闭环的质粒 DNA 由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当加人乙酸钾等物质（在中性条件下）时，巨大的染色体 DNA 分子难以复性，而质粒 DNA 很快得以复性。同时，在高盐浓度的条件下，宿主染色体 DNA、蛋白质等形成不溶性网状结构，通过离心可
17、去除大部分细胞碎片、染色体 DNA、RNA 及蛋白质，而质粒 DNA 仍留在上清中，然后采用异丙醇或乙醇沉淀可得到质粒 DNA。通常在 DNA 样品的分析中，往往通过测量 OD 值来确定其浓度。DNA 的吸收峰在260nm 处，蛋白质的吸收峰在 280nm 处。用标准样品测得，在波长 260nm 下，1g / mL DNA 钠盐溶液的 OD 值为 0.02，即在 OD260=1 时，双链 DNA 含量为 50g /mL ，单链DNA 与 RNA 含量为 40g /mL，寡聚核苷酸的含量为 30g /mL（由于底物不同而有差异） 。这些标准数据使人们能定量测定核酸，但是当核酸的 GC 百分含量发
18、生较大变化时，也会导致这些数据的偏差。紫外分光光度法除可以测定核酸的含量外，还可以测定核酸的纯度。已知核酸在 260nm 处有碱基引起的强吸收峰，230nm 处有一吸收低谷，蛋白质在 280nm 处有一个由酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸引起的吸收峰，所以 OD260OD 280 的值能说明蛋白质对核酸的污染程度。一般认为纯净 DNA 的 OD260OD 280 约为 1.8，而纯净 RNA 的 OD260OD 280 约为1.8 2.0，样品中若含有蛋白质，会使 OD260OD 280 的值下降。当 OD260OD 280 小于 1.75时，该样品可适当稀释，用氯仿异戊醇抽提，重新用无水乙醇沉淀后
19、再进行测定。当DNA 样品的 OD260OD 280 大于 2 时，则 RNA 浓度过高，需要去除 RNA。但这样的评估对于不纯的样品没有意义，因为若 DNA 同时含有蛋白质和 RNA 也会使比值落在 1.8 左右，这时应进行电泳鉴定，以排除蛋白质和 RNA 同时存在的可能性。此外，还可以辅以 OD230测定，OD260/OD230 的值应大于 2.0，小于该值时表明样品中有残存的盐和小分子杂质。所提取的质粒 DNA 可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。一般情况下，提取的质粒为 3 条带（图） 。在细胞内，质粒 DNA 是共价闭环 DNA (covalently Closed circular DN
20、A )，常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环 DNA（open circular DNA )；若两条链在同一处或相近的部位断裂，则变成线性 DNA 分子。在电泳时，同一质粒的电泳速度因 DNA 的构型不同而异，其速度从大到小的次序为：cccDNA线性 DNA ocDNA，共价闭环 DNA 的泳动速度最快。但在优化条件下，如在冰浴中或用试剂盒提取时，可以只出现一条带或主要出现一条带，即超螺旋带。图 质粒 DNA 琼脂糖凝胶电泳图MHind ；1，2，3，4-pBI121；5，6pActlIsGFP-1提取的质粒 DNA
21、经 RNase 消化后，可直接使用或经进一步纯化后用于其他分子生物学实验。纯化后的质粒 DNA 可用分光光度计检测其纯度和浓度。本实验采用碱裂解法小量提取质粒 DNA，包括载体质粒 DNA 和重组质粒 DNA，用于进一步的转化、酶切和 PCR 等实验。2. 目的掌握质粒 DNA 的提取和检测方法。3. 主要试剂和材料(1)LB 液体培养基 胰蛋白胨 10g /L，酵母提取物 5g /L ,NaCl 10g/L, pH7.0。(2)STE 溶液 0.lmol/L NaCI, 10mmol/L TrisCl ( pH8.0), 1mmol / L EDTA ( pH8.0） 。(3)溶液 I 50
22、mmol/L 葡萄糖，25rnmol/L TrisCl(pH8.0 ) ,10mmol / LEDTA ( pH8.0） 。(4)溶液 0.2mol /L NaOH, l % SDS；使用前用 0.4mol / L NaOH 和 2%SDS 等量混合。(5)溶液 5mol/L 乙酸钾 60mL，冰乙酸 11.5mL，水 28.5mL。(6)TE 10mmol/L TrisCl(pH8.0),lmmol/L EDTA (pH8.0） 。(7)其他 氯仿异戊醇（24 : 1） ，无水乙醇，70乙醇。4 主要仪器设备恒温摇床，离心机，涡旋振荡器，微量移液器，水浴锅。5. 实验步骤（1）从选择性培养平
23、板上挑取单菌落，移至含有相应抗生素的 LB 液体培养基中，于 37 振荡培养过夜（不要超过 16h ） 。（2）将 1.4mL 培养物移至 1.5mL 离心管中，12000r / min 离心 lmin 。（3）弃上清（一次性地将液体倒出，并用滤纸吸净管口残余的液体，尽量避免液体重新流回管底） ，用 lmL STE 溶液重悬细菌沉淀，12000r/min 离心 lmin。（4）弃上清，细菌沉淀重悬于 100L 冰预冷的溶液 I 中（注意：重悬时应使细菌沉淀完全分散） 。（5）加入 200L 新配制的溶液，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混匀内容物，之后将离心管置于冰上 2min（注意：混合
24、的动作要温和） 。（6）加入 150L 用冰预冷的溶液，盖紧管口，颠倒使之混匀，之后将离心管置于冰上 10min。（7）4 、12000r / min 离心 5min，将上清转移到另一离心管中。（8）加入等体积的氯仿一异戊醇（241 )，颠倒混匀 5min ,12000r / min 离心5min。（9）将上清移入另一离心管中，加入冰预冷的 2 倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置 l0min。（10）4 、12000r / min 离心 10min。（11）小心弃去上清，加入 lmL70 乙醇洗涤 DNA 沉淀（可使沉淀脱离管壁） 。（12）4 、12000r / min 离心 10min
25、 。（13）小心弃去上清，室温放置使乙醇挥发或在超净工作台内吹干沉淀（约需 20 30min )，沉淀呈半透明状闻不到乙醇的味道时即可，不可过于干燥。（14）将沉淀溶于 50L 灭菌的 TE 或 ddH2O 中，取 5 L 进行电泳观察并照相。（15）加入 RNase（终浓度 2050 g /mL ), 37消化 40min，取 5L 进行电泳观察并照相。此时 DNA 溶液可保存于 4 或-20 下以用于酶切和 PCR 反应等，如需要进一步纯化，则继续完成以下实验步骤。（16）加水将体积补至 400L，重复步骤（8）（13） （注意：在第（9）步加人无水乙醇以前要按照表 33 的要求加人一定量的盐） 。（17）将沉淀溶于 2L 灭菌的 TE 或 ddH2O 中，取 5 L 进行电泳观察并照相。
