1、REMI 转化体的质粒拯救一、原理限制性内切酶介导的整合（Restriction Enzyme Mediated Integration，REMI）技术是一种将待转化的 DNA 通过限制性内切酶介导整合到真核生物细胞染色体中的方法，在真菌中已经发展成为有效的转化和标记突变的方法。用 REMI 技术已经标记和分离出几种植物病原真菌的致病性相关基因。如玉米小斑病菌Cochliobolus heterostrophus T 小种的产毒素基因 Tox1 和 T 毒素生物合成所需要的直线聚乙酮醇(1inear polyketide)合成酶基因 PKS1（Lu et al.1994; Yang et al
2、. 1996） ；梨黑斑病菌 Alternaria alternata 日本梨致病型菌株中与 AK 毒素产生和致病性必需的 2 个基因 Akt1 和 Akt2（Tanaka et al. 1999）等。在稻瘟菌中，利用 REMI 技术已克隆了 10 多个致病相关基因，如 Pth11、CUT1 、MPG1、CPKA 等（DeZwaan et al., 1999; Sweigard et al., 1998; Lau and Hamer, 1998; Xu et al., 1997; Balhadere et al., 1999） 。在稻瘟菌的 REMI 转化以获得突变体中，转化用的质粒以随机的方
3、式插入到稻瘟菌的基因组中，这个质粒除了带有一个真核选择标记如潮霉素抗性基因外，仍然具有细菌质粒的复制位点和抗性基因。拯救就是将此质粒及它所插入位置的侧端序列从基因组中拿出来的过程。其原理图如下：选用合适的限制性内切酶完全消解基因组 DNA，进行 DNA 片段的自身环化后，再转化大肠杆菌，包含有细菌质粒的复制位点和抗性基因的环化的 DNA 片段就能在抗性平板上长出。根据所选用的限制性内切酶的不同可分为两种不同的策略，一种是选用 REMI 转化所用的质粒中有一个酶切位点，且不破坏细菌质粒的复制位点和抗性基因的限制性内切酶，在这种策略中被拯救的质粒中带有插入位置一侧的稻瘟菌基因组 DNA 序列，如上
4、图中向左的箭头所指；另一种策略是选用 REMI 转或Inserted plasmid化所用的质粒中没有酶切位点的限制性内切酶，在这种策略中被拯救的质粒中同时带有插入位置两侧的稻瘟菌基因组 DNA 序列如上图中向右的箭头所指。这样，通过质粒拯救就能获得部分插入位置的侧端序列。二、实验材料和设备A 实验材料：1.突变体 X54 的基因组 DNA；2.限制性内切酶 HindIII， EcoRV（Takara,大连） ；3.T4 DNA 连接酶（Takara,大连） ；4.苯酚：氯仿（异戊醇） ，3M 醋酸钠，70%乙醇，无水乙醇，TE（pH8.0） ，ddH2O；5.培养基：LB，SOB（配方参照分
5、子克隆第二版）6.电击感受态细胞 JM109；B 实验设备：1.恒温水浴2.台式高速冷冻离心机3.电击转化仪三、实验步骤1 用合适的限制性内切酶酶切 5-10ug 基因组 DNA。2 待酶切完全后，用苯酚：氯仿抽提以失活限制性内切酶。3 加入 1/10 体积 3M 醋酸钠和 2 倍体积无水乙醇，-20沉淀一小时以上。4 13000rpm，4离心 15 分钟，去上清，沉淀用 70%乙醇洗两遍，无水乙醇洗一遍，自然晾干或真空抽干。5 用 50-100ulTE 溶解 DNA。6 在下列反应体系中 16连接过夜。ddH2O 78ul10xbuffer 10ulT4 DNA 连接酶 2ulDNA 10u
6、l(1ug)7 65处理 10 分钟，以失活 T4 DNA 连接酶。8 加入 1/10 体积 3MNaAC 和 2 倍体积无水乙醇，-20沉淀一小时以上.9 13000rpm，4离心 15 分钟，去上清，沉淀用 70%乙醇洗两遍，无水乙醇洗一遍，自然晾干或真空抽干。10 用 5ul ddH2O 溶解 DNA。10. 电击转化：电压 2.5KV， 0.2cm 电击转化杯，将 5ul ddH2O 溶解 DNA 全部加入 40ul 电击感受态细胞中进行电击转化。11. 用 800ulSOC 悬浮感受态细胞，37，缓慢摇培 1 小时，均匀涂布于含有100ug/ml 氨苄的 LB 培养基上，37培养过夜
7、。四、参考文献Lau G.W., Hamer J.E. Acropetal: a genetic locus required for conidiophore architecture and pathogenicity in the rice blast fungus. Fung. Genet. Biol.1998, 24 (1/2): 228-239Xu J.R., Urban M., Sweigard J.A. et al. The CPKA gene of Magnaporthe grisea is essential for appressorial penetration. Mol. Plant-Microbe Interact. 1997, 10 (2): 187-194Balhadere P.V., Foster A.J., Talbot N.J. Identification of pathogenicity mutants of the rice blast fungus Magnaporthe grisea by insertional mutagenesis. Mol. Plant-Microbe Interact. 1999, 12 (2): 129-142
