1、第九章 受体的放射性配基结合分析,第一节 概论,一、受体的概念 1.经典药理学早期提出的概念20世纪60年代前属药理学范畴。“化学性受体”：药物和敏感细胞某种成分发生化学结合，是药物的作用基础，细胞的这种化学成分即为“受体”Clark提出药物对受体的占领学说Ariens提出内在活性的概念局限性：观察的是药理效应，而不是生理效应；局限在药理学范畴无法观察化合物和受体分子结合解离的具体过程。,2.放射性配基引起受体概念发生质的变化受体分子数仅占细胞总蛋白的十万分之一到百万分之一，一般方法难以直接分离和测定，也难以对结合的配基精确定量。 放射性核素标记配基的出现，解决此问题，并把受体的研究领域扩展到
2、神经递质、激素、免疫因子、生长因子等各领域。配基：与受体发生特异结合并且引起相关效应的化合物。探测灵敏度可达10-15mol直接观察配基在亚细胞组分中的分布，并定量。,放射性配基结合分析法（RBA）可直接分离出配基和受体的复合物，测定放射性，推算受体的数量及其与配基的亲和力。使受体的研究从间接观察（配基的效应）进入直接观察（配基与受体的相互作用），从宏观进入微观，并扩展到神经地址、激素、细胞因子、生长因子等的作用机理、细胞水平的调控机制、疾病的机理等领域。不足：不观察药理效应；以整个受体分子为观察对象，无法研究其结构、功能关系；研究新受体及亚型受选择性配基的制约，灵敏度受标记物限制。需与各种研
3、究手段相结合。,3.分子生物学技术与RBA相结合研究重点从受体与配基的结合特性研究机如受体结构与功能的关系研究。分子生物学克隆技术，可了解受体的氨基酸序列，并可合成甚至改造受体分子，但无法了解配基和受体分子的亲和力及结合的后续效应，需与RBA相结合。但若要进一步了解受体分子的高级结构或空间构象和受体功能的关系，需与其它技术相结合。,4.受体的现代概念 各种感觉（光、味、听、触、温度等）的感受器； 各种对特定化学物质（激素、神经递质、细胞因子等）起反应的受体。 受体的基本特点： 有特定氨基酸序列和特定立体构型的蛋白质； 有特定的宏观和微观分布； 含量少，占总蛋白的十万到百万分之一； 存在内源性配
4、基； 对特定信号的特定可逆结合能力，通过特定的信号传递系统引起的细胞特定反应。,受体的概念：是细胞中能识别配基（激素、神经递质、细胞因子、药物、毒物等），并与其特异结合，引起各种生物效应的，具有特定氨基酸序列和特定构型的一类蛋白质分子。二、受体与配基结合的基本特征 1.可饱和性； 2.特异性和高亲和力； 3.可逆性； 4.识别能力和生物效应的一致性。,三、受体的分类 1.膜受体：一般由胞膜外、胞膜内及跨膜区三部分组成。配基从细胞外侧与受体的胞外部分或跨膜部分上特定的结合位点结合，使受体分子发生构型变化，通过膜内部分将信息传给相应的信息传递机制，引起细胞功能变化。 配基门控离子通道受体 G蛋白偶
5、联7次跨膜受体 有酶结构的单次跨膜受体 无酶结构的单次跨膜受体,2.核受体无跨膜区段，整个氨基酸链都在细胞内，配基都是脂溶性物质，透过细胞膜而在细胞内和受体分子结合，直接作用于细胞核的DNA链，对特定的基因表达起调节作用。 四个功能区： A/B区选择和激活基因转录，不同受体差异最大 C区与染色体DNA结合区 D区受体在核内的定位 E区配基结合区，并有转录激活作用,3.受体的型和亚型一种内源性配基的受体划分为一个型；内源性配基相同而氨基酸序列同源性高的受体可列为同一型的不同亚型；不同的亚型可找到不同的高亲和力外源性配基；不同的亚型在后续传导机制往往有差异。四、受体的调节增敏、失敏同系调节、异系调
6、节五、受体与疾病,第二节 受体与配基结合反应 的基本原理,一、质量作用定律,二、受体与配基反应的动力学 三、饱和曲线v1=k1RL；v2=k2RL当v1=v2， k1RL=k2RL RL2RL(LTKDRT)LTRT0KD：配基与受体的亲和力，平衡解离常数。 四、Scatchard作图,五、正、负协同作用 六、Hill作图 判断受体和配基结合的分子比。 七、非特异性结合（NSB）非特异性蛋白质、容器、分离材料与配基结合。特点是亲和力低，结合容量大。 八、竞争性取代反应,第三节 受体放射性配基结合分析的基本方法,制备标本加样孵育分离测量数据处理 一、受体标本的制备 1.组织切片：冷冻切片，850
7、m 2.游离的完整细胞悬液 3.分离亚细胞组分：差速离心法分离胞膜、胞浆、胞核；可除去杂蛋白、内源性配基，浓缩受体蛋白。 粗膜制剂、洗膜制剂 4.可溶性受体蛋白,二、标记配基的选择 1.对放射性配基的基本要求 高比活度 高亲和力 高特异性 高放化纯度及高稳定性 2.放射配基的用量 多点饱和曲线实验 单点法 竞争结合实验,三、非标记配基的选择作用：测定NSB；在竞争取代反应中作竞争剂用量：为标记配基的5001000倍要求：能与标记配基竞争同一受体，且亲和力要高 四、温度与孵育时间温度高，结合快，达反应平衡时间短；温度低，反应时间长，复合物解离少，有利于稳定 五、结合与游离部分的分离 1.对完整细
8、胞、胞膜、胞核受体 2.对溶脱的核受体、膜受体，胞浆中的核受体 六、结合反应类型,第四节 数据处理,一、单点饱和分析法的单位换算 把cpm换算成fmol数，在算成RT（fmol/mg蛋白）,二、多点饱和分析法Scatchard作图y=a+bx,实验三 单位点饱和曲线法测定大鼠脑M受体RT、KD,一、实验原理受体和配基的结合反应属可逆反应，服从质量作用定律，为一级动力学，当结合反应达平衡时：R游离受体；L游离配基；k2/k1KD； RT加入受体的浓度；LT加入的配基浓度； RL受体-配基复合物,饱和曲线：RL2RL(LTKDRT)LTRT0 随着加入的LT的变化，RL也随之变化。Scatchar
9、d作图：二、仪器及试剂 1.仪器：匀浆器、低速冷冻离心机、超速离心机、恒温水浴、混悬器、多头细胞收集器、液闪仪、加样枪等。,2.试剂： 淋洗缓冲液（B1）：50mmol/L pH 7.5磷酸缓冲液，含10mmol/L MgCl2； 制备缓冲液（B2）：B1液含0.25mol/L蔗糖； 标记配基3H-QNB：一般用前用B1稀释至60008000cpm/50l； 非标记配基：东莨菪碱或非标记QNB； 蛋白定量试剂：2碳酸钠(A)，0.5硫酸铜(B)，1柠檬酸钠(C)，临用前A:B:C 20:1:1混合；Follin液(用酚试剂配制)，标准蛋白溶液(0300mg/ml)； 闪烁液：0.5PPO； 玻
10、璃纤维滤膜：69型,三、方法与步骤 1.受体膜样本制备取脑，加约6ml B2液，匀浆，40005000rpm离心1015min，上清再约27000rpm离心1520min，沉淀即为含受体的膜样本，悬浮在2ml B1中，备用。 2.蛋白含量测定取50l膜液，用Lowry法测定蛋白含量。,混匀，室温反应15min，加3ml Follin液，室温反应45min，540nm测定OD值，计算蛋白含量。 3.结合反应（l）,以上操作均在冰浴中进行，加样完毕后，混匀，37恒温水浴30min。 4.分离将反应完毕的样本立即置入冰浴中，终止反应，并用多头细胞收集器抽滤至玻璃纤维滤膜上，用蒸馏水淋洗35次滤膜，取下滤膜，80烘干。 5.测量取下烘干的滤膜，放入1.5ml Eppendorf管中，加1ml闪烁液，放入液闪仪中测量cpm。 四、数据处理用RBA软件处理程序分析所测得的数据；用手工法计算受体RT值。,
