1、天津天士力集团研究院药理所 文件编号：1常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC 法： (注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯 5 分钟。2.切片经二甲苯 5 分钟。3.无水酒精 30 秒。4.无水酒精 30 秒。5.95%酒精 30 秒。6.95%酒精 30 秒。7.90%酒精 30 秒。8.80%酒精 30 秒。9.70%酒精 30 秒。10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是 1-10)11.0.3%H2O2 甲醇处理切片 10-20 分钟。12.水洗。13.抗原修复。14.PBS 洗 3 次，1 分钟/次。15.加入血清孵育 20 分钟。1
2、6.摔干血清，加入一抗 60 分钟。 17.PBS 洗 3 次，2 分钟/次。18 加入二抗孵育 30 分钟。19.PBS 洗 3 次，2 分钟/次。20.加入 ABC 复合物，孵育 30 分钟。21.PBS 洗 3 次，2 分钟/次。22.DAB-H2O2 孵育切片 5-10 分钟。23.PBS 洗，水洗。24.Harris 苏木素染核 5-10 分钟。25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。(二)、LSAB 法。 (SP 法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。天津天士力集团研究院药理所 文件编号：22.0.3%H2O2 甲醇处理切片 10-20
3、 分钟。3.水洗。4.抗原修复。5.PBS 洗 3 次，1 分钟/次。6.加入血清孵育 10 分钟。7.摔去血清，加入一抗孵育 30-60 分钟。8.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。加入二抗，孵育 20 分钟。9.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。10.加入 SP 复合物孵育 20-30 分钟。11.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。12.DAB-H2O2 孵育 5-10 分钟。13.PBS 洗，水洗。14.Harris 苏木素染核 5-10 分钟。15.水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。(三)真空负压 LSAB 法1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2 甲醇真空负压处理 5min
4、.3.水洗。4.如果需要，可进行抗原修复。5.PBS 洗 3 次，每次 1 分钟。6.加入正常血清真空负压处理 5min。7.摔干血清，加入第一抗体，真空负压处理 5 分钟。8.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。9.加入二抗(即连接抗体)真空负压处理 5 分钟。10.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。11.加入链卵蛋白复合物，真空负压处理 5 分钟。12.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。13.DAB-H2O2 孵育 5-10 分钟。14.PBS 洗，水洗。天津天士力集团研究院药理所 文件编号：315.染核，分化，蓝化，脱水，透明并封固。注：真空负压即将真空干燥中抽成真空。负压达 66.
5、7KPa(500mmHg)(四)Envision TM Systems.1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2 甲醇处理切片 10 分钟。3.水洗。4.抗原修复。5.PBS 洗 3 次，每次 1 分钟。6.加入一抗体孵育 30-60 分钟。7.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。8.加入增强剂孵育 20-30 分钟。9.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育 20-30 分钟。11.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。12.DAB-H2O2 孵育 5-10 分钟。13.PBS 洗，水洗。14.Harris 苏木素染核 5-10 分钟。15.水洗，分化，蓝化，脱
6、水，透明并封固。(五)免疫组化双染色法。( ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2 甲醇处理切片 10 分钟。3.水洗。4.抗原修复。5.PBS 洗 3 次，每次 1 分钟。6.加入非免疫性动物血清，孵育 10 分钟。7.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。8.加入第一抗体孵育 60 分钟。9.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。10.加入生物素化的第二抗体，孵育 10 分钟。天津天士力集团研究院药理所 文件编号：411.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育 10
7、 分钟。13.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。14.加入 DAB-H2O2 孵育 5-10 分钟。15.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。16.加入双染增强液，孵育 10 分钟。17.加入非免疫性动物血清孵育 10 分钟。18.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。19.加入选用的第二种抗体孵育 60 分钟。20.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。21.加入生物素标记的第二抗体孵育 10 分钟。22.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。23.加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育 10 分钟。24.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。25.加入 AEC 溶液，孵育 5-10 分钟。26.自来水洗。
8、27.苏木素染核 5-10 分钟。28.水性封片。注：1.第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。2.第 1 次显色也可用 BCIP/NBT 溶液，颜色为蓝黑色，但应与苏木素鉴别。(六)、免疫组化的双染色法( ) (Immuno-histochemistry double staining method)1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2 甲醇处理切片 10 分钟。3.水洗。4.抗原修复。5.PBS 洗 3 次，每次 1 分钟。6.加入选用的第一抗体孵育 30-60 分钟。7.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。天津天士力集团研究院药理所 文件编号：58.加入增强剂孵育 20-30 分钟
9、。9.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育11.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。12.加入 DAB-H2O2 孵育 5-10 分钟13.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。14.加入选用的第二种抗体孵育 60 分钟。15.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。16.加入增强剂孵育 20-30 分钟。17.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。18.加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育 20-30 分钟。19.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。20.加入 AEC 溶液孵育 5-10 分钟。21.自来水洗。22.苏木素染核 5-10 分钟。23.水性封片。(七
10、)细胞培养片免疫荧光染色法。1.将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。2.纯丙酮固定 10 分钟。3.PBS 浸洗 3 次，每次 1 分钟。4.加入选用的第一抗体孵育 120 分钟。5.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。6.加入荧光抗体孵育 60 分钟以上。7.PBS 法 3 次，每次 2 分钟。8.0.1%伊文氏蓝衬染 3 分钟。9.水洗，蒸馏水洗。10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。(八)真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。1.将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次，彻底洗去蛋白液。天津天士力集团研究院药理所 文件编号：62.纯丙酮固定 5-10 分钟。3.PBS 浸洗 3 次，每次 1 分钟。4.加入选用的第一抗体孵育真空负压处理 15 分钟。5.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。6.加入荧光抗体孵育真空负压处理 15 分钟。7.PBS 洗 3 次，每次 2 分钟。8.0.1%伊文氏蓝衬染 3 分钟。9.水洗，蒸馏水洗。10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。
