1、辣根过氧化物酶的色原底物 HRP 最常用的色原底物有邻苯二胺 (OPD)、2，2吖嗪(3 乙酰苯基噻唑磺酸6)2，2 azino-di(3ethylben2thiazolinesulphonicacid-6)，ABTS( 杂环吖嗪)、四甲基联苯胺(TMB)和 4氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。上述 色原底物受HRP 作用主要有两种形式的反应：氧化还原底物的氧化作用，如 OPD、ABTS 等；一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如 4氨基安替比林：苯酚等。 (一) 氧化还原色原底物 OPD 被认为是 HRP 最为敏感的色原底物之一，其在 HRP 的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而
2、聚合成 2，2二氨基偶氮苯(DAB)。在 pH50 左右时，DAB 在波长 450nm 处有广范围的最大吸收，当 pH 值降为 10 时，最大吸收波长移动至 492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深(图 42)。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。 实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化 OPD 而产生非酶催化的 DAB 的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了 OPD 的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。OPD 的缺点是其对机体具有致突变
3、作用。由于 OPD 的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD 均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。 在 ELISA 测定时， OPD 色原底物的具体配方为显色底物溶液：在 01molL 枸橼酸盐缓冲液(pH50)中含 20 mmolL OPD 和 12 mmo!L H202，或 10 mmolL OPD 和 55mmolL H202；终止液：2 molL 硫酸(含 01 molL 亚硫酸钠)；测定波长：492nm。 TMB 是一种优于 OPD 的新型 HRP 色原底物。其氧化产物联苯醌在波长 450nm 处有最大消光系数，如果 HRP 量少，过氧化氢溶液和 TMB 过量时，则形成蓝色
4、的阳离子根。降低 pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌(图 43)。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定 90min，但随后本底显色就不断加深，国内有人认为使用 1SDS 作为终止剂，可使鲜蓝色 24h 内保持不变，阴阳性对比十分明显，但在我们实验室发现 1SDS 对上述显色有较强的褪色作用，目前仍以硫酸作为终止剂较为理想。ELISA 中，底物反应显色后，常选择其具最大吸收的波长 450nm 比色测定结果。而Madersbacher 和 Berger 等为提高以 TMB 作底物的 ELISA 测定的敏感性，选择显色呈指数加深时的波长 405nm 比色测定。他们首先测定一系列已知浓度的标准品在
5、450nm 和 405nm 的值，证实 A450nmA405nm 之比为 32，然后在使用波长 405nm 测定含低浓度待测物的标本得到的 OD 值再乘以常数 32，即为待测标本在波长 450nm 处的真值。该种双波长测定方法可使 ELISA 测定范围提高 3 倍。TMB 的显色反应虽与 OPD 一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素 C 及亚硫酸钠、SDS 等) ，则可反应显色迅速消退。TMB 虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了 OPD 而成为 HRP 最为常的色原底物。 在商品 ELISA试剂盒尤其是国内的产品中，TM
6、B 色原底物常为已配好的 A 及 B 两种液态试剂，其中一种是含一定浓度过氧化氢的溶液，一种为 TMB 溶液，鉴于过氧化氢、TMB 在溶液中相对不稳定的特点，因此，我们在使用 ELISA 试剂盒时，如发现底物 A 和(或)B 出现颜色，或二者各取一滴混合后显色，说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。 在ELISA 测定时，TMB 色原底物的具体配方为显色底物溶液：先将 TMB 以 01 molL的浓度溶于二甲亚砜，然后，再将其以 1 mmolL 和 H202 以 30 mmolL 的浓度溶于02molL 醋酸钠枸橼酸缓冲液(pH40) ，即可应用。终止液：2 molL 硫酸。测定波
7、长：450nm。 ABTS 也是 HRP 的一种高灵敏底物。在 H：O ：存在下，ABTS 的氨盐转变为易发生歧化的阳离子根(图 44)。阳离子根为绿色，与 OPD 的黄色氧化产物相比更适于可见光测定(测定波长入 414nm)。上述显色也不稳定，10 mmolL 叠氮钠是较为理想的终止剂，可使显色稳定数十小时，且可减少阳离子根的歧化。另有人报道用125NaF 终止反应效果较好。 ABTS 在目前国内的 ELISA 试剂盒中基本上没有应用，但在国外 ELISA 试剂盒偶见有应用。 在 ELISA 测定时， ABTS 色原底物的具体配方为显色底物溶液：先将 ABTS 以 2 mmolL 和 H20
8、2 以 25 mmo!L 的浓度溶于 01 molL 醋酸盐缓冲液(pH 42) ，即可应用；终止液：10 mmol L 叠氮钠；测定波长；414nm 或 405nm。 除上述三种外， HRP 的氧化还原底物尚有 O-dianisidine(ODA)，5氨基水杨酸(5AS)以及 dicarboxindine 等。 (二)氧化耦联色原底物对 HRP 的氧化耦联色原底物对主要有 4氨基安替比林：苯酚耦联底物对(Trinder 试剂)和 2甲基2苯并噻唑啉腙(MBTH)；二甲基苯胺 (DMA)耦联底物对(NgoLenhoff 试剂)等。 在 H202 存在下，4氨基安替比林和苯酚经 HRP 作用缩合
9、形成红色的醌亚胺，其在入492 nm 处有最大吸收(图 45)。 该耦联色原底物对用于固相 ELISA 时，敏感性一般较低，反应见光不稳定，而且苯酚易发生多聚化，缺乏适当的反应终止剂。因此，该试剂常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等临床生化指标的酶法检测应用。1989 年日本学者用其作为色原底物建立了一种以 HRP 作标记酶的均相酶免疫试验，可用甲醛终止反应。但这种方法仅停留在实验室阶段，其后也未见有其他实验室的应用报道，可能还有其固有的缺陷。 4氨基安替比林：苯酚耦联底物对色原底物的具体配方为显色底物溶液：将 4氨基安替比林以 2 mmolL，苯酚以 25 mmolL 和 H202 以 08 mmolL 的浓度溶于 01 molL 磷酸盐缓冲液(pH7 2)，即可应用； 终止液：未见报道； 测定波长：492nm 。 MBTH 和 DMA 在HRP 的作用下缩合生成紫蓝色的吲达胺(indamine)，最大吸收波长为 590nm，见光不稳定。用盐酸或硫酸终止反应后，pH 应为 30 左右，pH 值的降低使显色从紫蓝色转变为清晰的蓝色，最大吸收波长从 590nm 变为 595nm，然而 pH 值的进一步降低，将导致光吸收消失。MBTH：DMA 耦联对在固相 ELISA 测定几乎没有应用。
