1、选择茶树不同品种，每个茶枝接种 5 头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO ）活性的测定适量茶鲜叶（3g）,料液比 1:2，加入内含 5%PVP（w/v）经遇冷的 pH 为7.2 的柠檬酸- 磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）,冰浴研磨，隔夜浸提 12h，于 4、9000r/min 离心 35min，取上清液，过滤得到初酶液。取 200ml 初酶液，加入 0.1mol/L 柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.6)20
2、0uL,混合反应液 1.2ml（0.1mol/L 柠檬酸-磷酸盐缓冲液：0.1 脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3） ，反应 30min（37 恒温水浴锅） ，6mol 尿素 1.2ml 终止反应，460nm波长测吸光度。对照为不加邻苯二酚的反应混合液。酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在 460nm 处吸光度值每分钟增加 0.01 为一个活性单位。2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定称取新鲜样品 0.5g 于预冷研钵中，加入 6ml 0.1mol/L（pH8.8 ）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀
3、后在 4冰箱中浸提 4h。410000r/min 离心 20min，取上清液即为酶提取液。取酶提取液 0.2ml，加入由硼酸钠缓冲液配制的 0.1mol/L L-苯丙氨酸，2.8ml 蒸馏水，摇匀，在 40水浴上反应 30min，冰浴中终止反应，测定OD290 值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL 的酶活性以每小时在 290nm 处吸光度变化 0.01OD 为一个活力单位。3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定取 0.2g 新鲜样品，加 7ml 经 4预冷的 1mol/L（pH7.6 ）的 tris-HCL 缓冲液冰
4、浴上研磨。4、12000r/min 离心 25min,上层清液即为 LOX 酶提取液。以 2.4ml0.1g/L 亚油酸作为底物，加入 0.1ml 酶液在 234nm 处测定吸光值，每隔 30s 读数一次，共测 5 分钟。Lox 酶活性单位以每分钟在 234nm 处吸光度变化 0.01OD 作为一个活力单位。4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）取 0.5 克剪碎叶片于预冷研钵中，加入 5ml 的提取介质 0.05mol/L PH7.8的磷酸缓冲液（含 1%PVP聚乙烯吡咯烷酮） （先加 3ml 研磨，再加 2ml 冲洗研钵），研磨匀浆，转入离心管后于冰箱中冷提 12h。1000r/
5、min 离心 20min,得到酶初提液。取 200mlPBS磷酸缓冲液 （0.2M ，pH6.0） ，加入 0.076ml 液体（原液）愈创木酚（2- 甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入 0.112ml 30%的 H202,混匀后保存于冰箱中备用。取 3ml 反应液并加入 30ul 酶液，以 PBS 为对照调零，而后测定 OD470 值（测定 30s 读数一次，5 分钟） 。 （边加样边测定，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始计时的时间相差不大）酶活性计算：以每分钟 OD 值得变化（升高）0.01 为一个酶活性单位（u） 。POD=（ A470 Vt）/（ WVs0.01t）(u/g m
6、in) A470：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提取酶液总体积（ml，(1.6ml） ；Vs 为测定时取用酶液体积（ml，30ul ） 。5、过氧化氢酶（Catalase CAT）活性测定取 0.5 克剪碎叶片于预冷研钵中，加入 5ml 的提取介质 0.05mol/L PH7.8的磷酸缓冲液（含 1%PVP） （先加 3ml 研磨，再加 2ml 冲洗研钵） ，研磨匀浆，转入离心管后于冰箱中冷提 12h。1000r/min 离心 20min,得到酶初提液。取 200ml PBS（0.15M ，pH7.0） ，加入 0.3092ml 30%的 H2O2（原液）摇匀即可。取 3ml 反应液加入 0.1ml（可视情况调整）酶液，以 PBS 为对照调零，测定OD240（紫外） 。 （测定 30s 读数一次，5 分钟） 。 酶活性计算：以每 min OD 值减少 0.01 为 1 个酶活性单位（u） 。CAT=A240Vt /（WVs0.01t） (u/g min) A240：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g)；t 为反应时间(min)；Vt 为提取酶液总体积（ml， 1.6ml） ；Vs 为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml） 。
