1、 分子考试资料整理1. 质粒 DNA 的构型与电泳速率的关系？答：DNA 分子的迁移速率取决于由 DNA 分子的大小与构型而形成的分子筛效应。在相同的构型下，DNA 分子迁移速率与其相对分子量成反比。相同分子量但不同构型的 DNA 分子迁移速率不同。当琼脂糖凝胶的浓度较低时，电泳速率为：超螺旋 DNA线性 DNA开环 DNA。2. 碱裂解法提取质粒 DNA 的原理以及三种溶液的作用？基本原理质粒的分离是利用质粒 DNA 与染色体 DNA 在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与 DNA 发生变性，由于染色体 DNA 与质粒 DNA 拓朴构型不同,
2、染色体 DNA 双螺旋结构解开，而共价闭环质粒 DNA 的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液 pH 调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体 DNA 之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS 复合物等形成沉淀；不同的是，质粒 DNA 复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体 DNA、RNA 及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA。三种溶液的作用（ 溶液 I，50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液 II，0.2 N
3、 NaOH / 1% SDS (新鲜的)；溶液 III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。）溶液 I: Tris-Cl:适当 pH 值,葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械剪切力作用而降解,悬 浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部,EDTA:抑制 DNase 的活性，和抑制微生物生长(是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂)溶液 II：NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂。这一步要记住两点：第一，不能用旧的 NaOH；第二，时间不能过长， 必须温柔混合，不然基因组 DNA 也会断裂。SDS: 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜
4、蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 溶液 III：醋酸钾: K+离子会与 SDS 形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去；高浓度的盐，使得沉淀更完全（在 pH 为 8 左右的溶液中，DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc 或 KAC，使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀）。2 M 的醋酸:中和 NaOH，创造质粒复性的环境。3. 感受态细胞制备过程应注意的问题；细胞的生长状态和密度最好从-70甘油保
5、存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在 5107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的 OD600（0.4-0.5）控制。（应注意 OD600 值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同；受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。质粒 DNA 的质量和浓度一般地，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%；对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低；重组 DNA 分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性
6、重组质粒高 10-100 倍。整个操作过程均应在无菌条件下进行 ，所用器皿及试剂都要灭菌。用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴 CaCl2 处理后细胞很脆，动作要轻，慢。化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；4. 挖胶过程应注意什么？保证切下的条带没有外源 DNA 的污染。切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积。切胶时尽量在长波长下进行，减少紫外对 DNA 的损伤。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄
7、的胶来做，可采用薄而宽的梳子来跑胶。5. 如何灭活 RNase？A. RNase 灭活剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对 RNA 酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和 RNA 酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制 RNA 酶的活性。 RNA 酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来
8、的酸性糖蛋白。RNasin 是 RNA 酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种 RNA 酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用。B.RNase 灭活剂C.玻璃器皿 200高温烘烤 2 小时D.塑料器皿焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液处理。6. 提取 RNA 和 DNA 时所用的饱和酚有什么不同？水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和酚的 PH 小于 7，一般是 PH 为 5.0 左右，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于细胞 RNA 的提取，在酸性环境中，DNA 在酚相，RNA 在水相。两者就分开了。Tris 饱和酚一般 PH 大于 7.8，用于 DNA 的提取。其中，酚是强
9、的蛋白变性剂，可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。 由于 PH 值大于 7，在碱性环境中 DNA处于水相，RNA 处于有机相。从而分离上清，即可得到 DNA。7. 如何减少蛋白诱导过程中包涵体的产生？降低诱导温度，一般 15-25降低诱导剂 ITPG 浓度使用中等强度或弱的启动子进行融合表达增加蛋白质折叠的添加剂与伴侣分子和折叠酶共表达选择突变的菌株优化培养基条件7. 单酶切时，为提高连接效率应采取什么措施？为什么？通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其末端的磷酸基，防止环化，通过连接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。8. 连接反应中，插入片段与载体的合适比例是多少？载体与目的基因摩
10、尔数之比为 1：3-5 如果插入片段较小，而载体较大，和载体的摩尔比例 3-6:1 连接效果好，如果载体和插入片段大小相近，摩尔比1：1 较好；如果插入片段和载体的摩尔比例过大，会导致多克隆的插入；如果插入片段和载体的摩尔比例过小，会导致假阳性增多。 9. 筛选阳性克隆的方法？菌落 PCR、酶切鉴定、Cracking gel、菌落原位杂交、测序10. 蓝白斑筛选的原理是什么？如何出现大量蓝斑，可能是什么原因？蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：许多载体（PUC 序列）都带有一个大肠杆菌的 DNA 的短区段，其中有 -半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前 146个氨基酸的编码信息。在这个编码区
11、中插入了一个多克隆位点（MCS）。受体菌含编码 -半乳糖苷酶 C 端 aa 序列。当无外源基因插入时，载体表达的 N 端-半乳糖苷酶多肽与受体菌表达的 C 端 -半乳糖苷酶多肽功能互补，具有-半乳糖苷酶活性。可以将生色底物 X-gal 分解成蓝色物质，从而在培养基中形成蓝色菌落。然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，造成插入失活，而使表达的产物不具有 -半乳糖苷酶活性，不能分解底物 X-gal，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。原因：1）载体与目的基因连接做的不好，重组质粒太少，大量的自连载体进入感受态细胞。2）酶切不完全，未被酶切的空载体进入感受态细胞。11. 已知一个基因的核酸
12、序列，如何进行蛋白表达？步骤？目的基因的获取：提取 RNA，反转录成 cDNA，以 cDNA 为模板，根据核酸序列设计引物，PCR 扩增目的基因克隆载体的选择与构建：提取质粒 DNA重组质粒的构建，即外源基因与表达载体的连接：双酶切，电泳检测，切胶回收目的片段，连接，获得重组质粒。重组 DNA 导入受体菌：转化，将重组质粒导入受体菌 重组体的筛选：用菌落 PCR 方法筛选阳性克隆，并将阳性菌落保存留种。克隆基因的表达：先将菌种复苏、扩繁；用 IPTG 分别诱导阳性克隆菌和空载体菌；取适量蛋白样，处理好后，上样、跑胶，染色、脱色、拍照。观察重组蛋白的表达情况。a. 对于阳性克隆菌，向 5ml 菌
13、液中加入 IPTG 至终浓度 0.6mM（30ul 0.1M IPTG），继续震荡培养；b. 对于空载体菌，向 5ml 菌液中加入 30ul 0.1M IPTG （终浓度 0.6mM IPTG）；12.质粒的特点是什么？结构：大多为共价、闭合环状、超螺旋（circular covalently closed DNA,cccDNA)功能：正常生长非必须的，但赋予细菌某些性状特征（具有遗传标记）复制和遗传：细菌内的共生型遗传因子，其复制独立于细菌染色体,但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。可以转移。13.PCR 的原理是什么？PCR 程序通常有哪几个步骤？聚合酶链式反应 (Polymerase
14、Chain Reaction，PCR）是模拟体内 DNA 的复制过程，在体外特异性扩增 DNA 片段的方法，从而获得大量的同一序列 DNA。 每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过 n 次循环后，模板分子数变为原来的 2n倍。步骤：PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延
15、伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟， 23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。14.当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？答：要避免星活性及部分酶切。（1）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（2）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将 DNA 重新溶解与适合第二种酶的
16、缓冲液，加第二种酶消化；（3）先低温酶，后高温酶；（4）使用通用缓冲液。15.大肠杆菌转化（CaCl2 法）的原理？0下，细菌处于 CaCl2 的低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，DNA 与CaCl2 形成羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经 42短时间热击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子基因得以表达，在抗生素选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。16.感受态细胞制备及转化中的影响因素？细胞的生长状态和密度最好从-70甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在 5107
17、个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的 OD600（0.4-0.5）控制。（应注意 OD600 值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同；受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。质粒 DNA 的质量和浓度一般地，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%；对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低；重组 DNA 分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高 10-100 倍。整个操作过程均应在无菌条件下进行 ，所用器皿及试剂都要灭菌。用
18、纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴 CaCl2 处理后细胞很脆，动作要轻，慢。化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；17.CaCl2 法制备感受态细胞转化 DNA 时，低温的主要目的是什么？热休克温度和目的是什么？低温目的：（1）抑制细胞的旺盛生理代谢；（2）有助于 DNACa2+吸附于细胞表面（3）防止 DNAase 降解 DNA 。 热休克温度是 42；目的是使细胞摄入吸附于其表面的 DNA。1
19、8.影响 PCR 扩增的因素有那些？引物的质量与特异性；PCR 循环条件（退火温度）；Mg2+浓度；模板 DNA 的质量；酶的质量。 19.引物设计的基本原则？引物长度一般在 1825 碱基之间。避免引物内和引物之间的二级结构两个引物的 Tm 值要接近。 G+C 含量在 40%60%之间，避开局部富含 GC 或 AT，3端避开 AT rich 结构 碱基要随机分布。 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补，特别是 3末端的 3 个碱基。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。引物 5端可以修饰，引物 3端不可修饰。20.SDS-PAGE 的原理？SDS 是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分
20、子之间以及其他物质分子之间的非共价键， 使蛋白质变性而改变原有的构象。蛋白质分子与 SDS 充分结合。PAGE 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称 Acr)和交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称 Bi )在加速剂 N N N N-四甲基乙二胺(简称 TEMED)和催化剂过硫酸铵 (简称 AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。21.SDS-PAGE 电泳的速率为什么只与蛋白的分子量有关，而与所带电荷多少无关？蛋白质分子与 SDS 充分结合后，所带的 SDS 的负电荷远远大于蛋白质本身的电荷量，因而就掩蔽或消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异对电泳迁移率的影响。电泳迁移率主要取决于
21、蛋白质的分子量。22.提取 RNA 过程中，怎样才能有效地降低材料本身给 RNA 提取带来的降解？ 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免 RNA 的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接
22、加入裂解液中匀浆，RNA 也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 外源 RNA 酶的污染：试剂，器械及实验环境中的 RNA 酶进入实验系统。内源 RNA 酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高 23.异硫氰酸胍法提取 RNA 的原理？异硫氰酸胍可以裂解细胞释放出核酸，并同时使蛋白质变性，抑制内源的RNase 活性。在酸性条件下（NaAc pH4.0），RNA 溶于水相，而 DNA 溶于有机相。这样，在加入苯酚/氯仿后
23、，RNA 就溶于上层水相中，而 DNA 溶于下层苯酚/氯仿中，蛋白处于中间层。含有 RNA 的水相被转移出来以后，在异丙醇的作用下沉淀，从而被分离出来。24. 理想状态下 DNA、RNA OD260/280 分别为多少？在什么范围比较合适？偏大或偏小分别说明什么？基因组 DNA 1.72.0: RNA 污染理想的 RNA2.0, OD260/280 在 1.9-2.1 之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高 RNA 可能已发生降解。 如果 OD260/OD280 过低（25 min ；异丙醇沉淀：0.6-1 倍体积的异丙醇。39.mRNA 的分离纯化：采用 Oligo dT-纤维素，从总
24、RNA 中分离出 mRNA。该法利用 mRNA 3末端有 Poly（A）的特点，在总 RNA 流经寡聚（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下， mRNA 被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来。一般而言，经过二次 Oligo dT 柱后，可得到较高纯度的 mRNA。40.核酸的贮存DNA 保存：1）短期贮存： 4或-20存放于 TE（Tris 和 EDTA）缓冲液中。TE 缓冲液(PH 为 8)，可减少 DNA 脱氨反应；EDTA 可以抑制 DNase 的活性。2）长期贮存：TE 缓冲液中-70保存数年；41.提取基因组 DNA 主要试剂的作用：EDTA： 二价金
25、属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性SDS 的作用：溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对 RNA、DNA 酶有抑制作用；与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性蛋白酶 K：水解蛋白质的作用，消化 DNA 酶和细胞中的蛋白质；蛋白酶 K 与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在 SDS、EDTA 存在时仍保持较高活性，可同时使用。苯酚的特点：蛋白质强变性剂、抑制 DNA 酶活性；苯酚溶于有机溶剂，微溶于水；提取 DNA 前苯酚用Tris-Hcl 饱和，防止吸收过多 DNA，降低 DNA 的损失率；氧化苯酚会破坏 DNA。42.为什么苯酚要重蒸饱和后
26、才能用于 DNA 的分离？苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于 DNA 分离，会使磷酸二酯键断裂，造成 DNA 降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用 Ttis-Hcl 饱和酚，并调节至中性。PH8.0 的 Tris 溶液可以使的抽提出的 DNA 进入水相，减少在蛋白质层滞留。在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。无水乙醇沉淀：沉淀前往往加入 NaCl 等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使 DNA沉淀析出。43.一个合格表达载体的组成要素：复制起始
27、位点 Ori 。即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因。可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加 poly（A）信号 可以起到稳定 mRNA 作用44.原核表达系统中的各因素：复制子 ：通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关 筛选标记和报告基因 ：氨苄青霉素 ，卡那霉素 启动子 ：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一 组成型表达 :组成型启动子 诱导调控型表达 :IPTG融合表达 ：GST, His-tag分泌
28、表达 :信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜 可溶性表达 :转录终止子 :控制转录的 RNA 长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降 核糖体结合位点 :多数载体启动子下游都有 SD 序列 表达菌株 :不同的表达载体对应有不同的表达菌株 45.对原核表达载体应该注意 3 点：选择合适的启动子及相应的受体菌；用于表达蛋白质时注意阅读框错位； 根据表达天然蛋白质或融合蛋白来选择相应的表达载体。46.琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为固体支持基质进行的电泳。主要利用DNA 分子在电场中泳动时的电荷效应和分子筛效应来达到分离混合核酸的目的。47.影响电泳速率的因素DNA 分子
29、量的大小、DNA 的分子构象、琼脂糖凝胶的浓度、电压、 电泳缓冲液的离子强度48.二型限制酶只需镁离子，识别切割特异性强，切割发生在识别位点。49.限制酶切割后的 DNA 电泳得到的电泳条带有些扩散 有蛋白质与 DNA 结合、 酶切条件不合适、有外切核酸酶污染、星号活性50.连接注意事项反应液：应有 ATP 和 Mg2+,而不要有高盐或 EDTA，应使 CIP,BAP 或 SAP 完全失活，DNA 应具 5磷酸基团。DNA 浓度：总 DNA 量应 1-10ug/ml, 否则太多 DNA 不能形成环状 DNA。目的基因：载体的摩尔浓度比应是 3：1。（经验：回收插入片段浓度 30ng/ul 左右
30、连接效率最好，大于 10ng/ul 比较保险，小于 5ng/ul 连接效率很低）转化时连接产物量：不能加太多连接产物到感受态细胞，一般是 50ul 细胞加1-5ul 连接物(约 12ng pDNA)酶量和反应时间：根据产家定义来决定，一般 16过夜或 25/1h实验结果的正确分析？实验一质粒 DNA 提取：T-easy Vector 质粒 DNA 浓度非常低（20-80ng/ul；proB 质粒 DNA 浓度较正常（80-220ng/ul）；电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，胶未完全凝固）；质粒 DNA 的带型分析；电泳条带浓度确定实验二：回收效率低的可能原因：1.胶块未完全溶解；可适当延
31、长水浴时间，并增加上下颠倒次数 辅助溶解；2. 胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；3.电泳缓冲液 pH 太高，硅基质膜在高盐低 pH 结合 DNA，如 pH 太高，应作适当调整；可在溶胶时加入 10ul pH5.0 3mol/L 的 NaAC；为使 DNA 更好拦截在膜上，可添 30%异丙醇在加热溶解后的液体里。4.漂洗液中的乙醇未充分挥发；5.加洗脱液时未加在膜上；6.洗脱效率低。加洗脱液后可在 55 度下 5min 或在 50 度 10min 再离心，等等。实验三：连接产物转化效率低的原因回收产物质量（挖胶回收过程中，紫外下曝光过长，DNA 或受到损伤）连接反应体系的问题：Buffer，ATP/Mg 离子，若 buffer 储存时间过长，ATP降解，导致连接失败。体系中盐浓度过高或 EDTA 含量高会导致连接失败。实验五 GST 的诱导表达：脱色不彻底；上样量稍多（蛋白浓度大）；离心不彻底；空载体表达出条带：增加胶浓度（12-15%）、延长电泳时间，以增加分辨率。
