1、第六章 发酵过程动力学及模型,1,1949年,莫诺改变了间歇培养,建立了连续培养方法,即以一定的速率不断地向混合均匀的发酵罐中供给新鲜培养基,同时等量排除发酵液,维持发酵罐中液量一定的培养方法。理论上,连续培养可使培养无限进行。连续培养中微生物所处的环境如底物和菌体浓度、比生长速率、pH等可维持稳定。因此,应用连续培养方法,使用各种限制性培养技术,可以建立高选择性的培养环境,从而为研究微生物对环境因子的响应、最佳环境条件下获得最好的培养效果提供了独特的工具和方法。,2,3,一、概述,1、发酵的实质:生物化学反应。2、发酵过程动力学主要研究各种环境因素与微生物代谢活动间的相互作用随时间而变化的规
2、律。3、研究方法 采用数学模型定量描述发酵过程中影响细胞生长、基质利用和产物生成的各种因素。,4,4、发酵过程的反应描述及速度概念,(1)、发酵过程反应的描述,XS(底物) X(菌体) P(产物),研究发酵过程的目的,发酵研究的内容:,菌种的来源找到一个好的菌种,发酵过程的工艺控制最大限度发挥菌种的潜力,5,(2)、发酵过程反应速度的描述,XS(底物) X(菌体) P(产物),基质的消耗速度:,(gL-1s-1),基质的消耗比速:,(h-1、s-1),单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物(菌体)的量称为比速,是生物反应中用于描述反应速度的常用概念。,6,5、发酵反应动力学的研究内容,研究反应速
3、度及其影响因素并建立反应速度与影响因素的关联,反应动力学模型,反应器特性,+,反应器的操作模型,操作条件与反应结果的关系,定量地控制反应过程,获取最大效益,6、已建立动力学模型的类型,机制模型:,根据反应机制建立,几乎没有,现象模型(经验模型):,目前大多数模型,能定量地描述发酵过程,能反映主要因素的影响,8,二、分批发酵动力学,微生物发酵有三种方式:即分批发酵(batch fermentation);补料分批发酵(fedbatch fermentation);连续发酸(continuous fermentation);,工业上为了防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题,大都采用分批发酵或补料分
4、批发酵这两种方式。其中补料分批发酵已被广泛采用,因为它的技术介于分批发酵和连续发酵之间、兼有两者的优点,又克服了它们的缺点。(见p130)各种不同发酵方式菌体代谢变化也不相同,但为了了解其基本变化,仍以分批发酵为基础来说明其代谢规律。,9,发酵中的菌体、基质和产物三者变化的基本过程是:菌体进入发酵罐后就开始生长、繁殖,直达一定的菌体浓度。其生长过程仍显示适应(停滞)期、对数生长期、静止(稳定)期和衰亡期等生长史的特征。,10,但在发酵过程中、即使同一菌种、由于菌体的生理状态与培养条件的不同,各个别期时间长短也不尽相同:如适应期的长短就随培养条件而有所不同,并与接种菌的生理状态有关。对数生长期的
5、菌种移植到与原培养基组成完全相同的新培养基中,就不会出现适应期,仍以对数生长期的方式继续繁殖下去。另外,用静止期以后的菌体接种,即使接种的菌体全部能够生长,也要出现适应期,因此,工业发酵中往往要接入处于对数生长期(特别是中期)的菌体,以尽量缩短适应期。,11,为了获得代谢产物,菌体尚未达到衰退期即行放罐处理;由于菌体生长繁殖和产物的形成,基质(如葡萄糖)浓度的变化一般是随发酵时间的延长而不断下降,溶解氧浓度也随发酵过程变化而发生变化。初级代谢产物由于没有明显的产物形成期所以它是随菌体生长在不断地进行的,有的与菌体生长成平行关系,如乳酸、醋酸、氨基酸和核酸等。,12,分批发酵中,微生物处于连续变
6、化的环境中,基质不断消耗,产物不断积累,环境条件不断变化,菌体不能长期处于旺盛的发酵期,发酵设备利用率低,单位体积时间的产物量也较少。,13,连续发酵中,微生物的生长代谢活动保持旺盛的稳定状态,而 pH、营养成分、溶解氧等都保持恒定,并从系统外部予以调控。这样就大大提高了设备利用率。与分批发酵相比较,连续发酵具有单位产量的反应器容积小,人工费用低,产品质量稳定及发应速率容易控制的优点。,14,尽管连续发酵具有上述优点,但是在实际发酵工业中,连续发酵还未能全部代替传统的间歇发酵。?在连续发酵试验和生产中,遇到了在长期连续发酵过程中,微生物的突变和杂菌污染的问题,欲保持长期的无菌状态,在技术上尚有
7、一定的困难;发酵液在连续流动过程中的不均匀性和丝状菌在管道中流动的困难,以及对微生物动态方面的活动规律还缺乏足够的认识。目前还不能根据连续发酵的理论完全来控制和指导生产。,15,虽然如此,连续发酵的优越性依旧不可忽视,特别是在连续发酵稳定状态条件下,根据微生物生长和代谢之间某些数学关系来采用它作为过程运转和控制的基础,从而来选定过程控制的参数。运用目前连续发酵的基本理论,人们可以人为地来控制微生物的定向培养,进而来研究微生物的生理及代谢作用。这些均是控制发酵过程中极为重要的问题。,16,微生物生长动力学,细胞反应过程包括:细胞的生长、基质的消耗和代谢产物的生成。细胞的生长繁殖过程既包括细胞内的
8、生化反应,也包括胞内和胞外的物质交换,具有多相、多组分、非线性的特点。细胞的培养和代谢是一个复杂的群体生命活动,伴随着每个细胞的生长、成熟、衰老,以及退化、变异等等。因此,合理简化,构建数学模型方能进行工程应用。,17,18,(一)、对微生物生长过程描述 见p107 对细胞群体进行描述,而不是对单一细胞;不考虑细胞间的差别;将细胞视为单一组成,不考虑环境对细胞组成的影响(非结构模型)或 考虑环境对细胞组成的影响(结构模型)认为细胞生长过程中,各组分以相同比例增加,即细胞均衡生长;将细胞视为单独的生物相(分离化模型)或将细胞与培养视为同一相(均一化模型);,几个基本概念,19,次级代谢产物:还有
9、一类产物,对细胞的代谢功能没有明显 的影响,一般是在稳定期形成,如抗生素等, 这一类化合物称为次级代谢产物。,初级代谢产物:微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。 如氨基酸、核苷酸等等,这些物质称为初级 代谢产物。,几个基本概念,得率系数:可用于对碳源等物质生成细胞或其他产物的潜力进行定量评价。对底物的细胞得率YX/S (g/g)生成细胞的质量与消耗底物的质量之比对氧的细胞得率YX/O (g/g)生成细胞的质量与消耗氧的质量之比对碳的细胞得率YC 一定小于1,一般在0.4-0.9之间,仅考虑基质与细胞的共同项碳,比YX/S更为合理,20,呼吸商(Respiratory Quotient简称R
10、Q)又称气体交换率,指生物体在同一时间内,释放二氧化碳与吸收氧气的体积之比或摩尔数之比,即指呼吸作用所释放的CO2和吸收的O2的分子比。,21,22,(二)、分批培养微生物生长动力学,时间,菌体浓度,延迟期,指数生长期,减速期,静止期,衰亡期,延迟期:,指数生长期:,减速期:,静止期: ;,衰亡期:,倍增时间:,23,指数期:,减速期:,静止期:,Kd:细胞死亡速率常数,衰亡期:,24,(三)、无抑制、单一限制性基质下的细胞生长动力学(Monod方程),细胞生长速率是底物浓度的函数,细胞生长速率与单一限制性底物浓度的关系,Ks:微生物对底物的半饱和常数,与亲和力成反比,g/L,Monod方程,
11、Monod研究了基质浓度与生长速度的关系Monod方程(1949),米氏方程:,微生物生长是细胞群体生命活动得综合表现,机理非常复杂, 实验现象的总结,酶反应机制推导,:菌体的生长比速 S:限制性基质浓度 Ks:半饱和常数max: 最大比生长速度,单一限制性基质:就是指在培养微生物的营养物中,对微生物的生长起到限制作用的营养物。,上式中 max 称为最大比生长速率,是在 S KS,且其他成分保持不变的情况下取得的。S 是限制性底物浓度。,当1/2max 时,有KS= S,所以,莫诺常数(或称半饱和常数)KS 代表当微生物的生长速率等于最大比生长速率的一半时的底物浓度;KS 表示微生物对底物的亲
12、和力。,当 S 时,m,说明 m只是理论上的最大生长潜力,实际上是不可能达到的。,28,实际上, Monod方程是在如下假设基础上建立起来的:,1)菌体生长为均衡型非结构式生长,因此,细胞成分只需要一个参数即菌体浓度表示即可。,2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物,其他营养成分不影响微生物生长。,3)将微生物生长视为简单反应,并假设菌体得率为常数,没有动态滞后。,29,(1) 当了限制性基质的浓度很低时,即 s Ks,细胞的生长速率与基质浓度无关,(3) 当处于以上两种情况时,30,s,细胞生长速率与限制性底物浓度的关系,Monod方程仅适用于生长较慢的细胞,此时细胞的生长才与基质浓度呈简
13、单的线性关系。,31,Monod方程求解方法,32,在一定条件下培养大肠杆菌,得如下数据:,S(mg/l) 6 33 64 153 221(h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70,求在该培养条件下,求大肠杆菌的max,Ks和td?,将数据整理:,S/ 100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221,33,max,1.11 (h-1); Ks97.6 mg/l,tdln2/ max0.64 h,例题,1.一发酵罐基质浓度为225g/L,细胞浓度0.15g/L,dX/dt=1.5g/h,当基质浓度为175g/L,细胞浓度为0.1g/L
14、,此时, dX/dt=0.875g/h,若细胞生长可用Monod方程描述,求动力学参数max、Ks?,34,解:已知 S1=225g/L X1=0.15g/L dX/dt=1.5g/h, S2= 175g/L X2= 0.1g/L dX/dt=0.875g/h,由Monod方程:,35,得:max=20h-1 Ks=225g/L,36,2.已知发酵罐内细胞总浓度为400g/m3 ,此时细胞浓度随时间变化率为0.02g/Lh,则求(1)细胞比生长速率;(2)若此时细胞处于对数生长期,细胞数量倍增时间td 。,37,解:已知:X=400g/m3,dX/dt=0.02g/Lh(1)由,h-1,(2)
15、td=ln2/0.693/0.05=13.86h,38,39,代谢产物生成动力学,1、Gaden对发酵的三分类与Pirt方程(a)相关模型(一类发酵) 产物的生成与细胞的生长相关的过程。产物的生成是细胞能量代谢的结果。,x,p,P120 图6-9,40,(b)部分相关模型(二类发酵) 产物的生成与基质的消耗仅有间接的关系。产物的生成是细胞能量代谢的间接结果。,Luedeking-Piret方程,41,(b)非相关模型(三类发酵) 产物的生成与细胞的生长无直接的关系。此模型中的产生多是次生代谢产物,在细胞的生长阶段没有产生累积。,42,Pirt方程,a + b,a=0、b0: 可表示一类发酵,a
16、0、b=0: 可表示二类发酵,a0、b0:可表示三类发酵,43,基质消耗动力学,S,S1 菌体,S2 产物,S3 维持,XS(底物) X(菌体) P(产物)+维持,维持消耗(m) :指维持细胞最低活性所需消耗的能量,一般来讲,单位重量的细胞在单位时间内用于维持消耗所需的基质的量是一个常数。,44,1、基质的消耗速率与比消耗速率 见p118 如果基质仅用于细胞的生长: 如果以氧的消耗来计算:,45,2、包括维持代谢的基质消耗动力学 要消耗额外的基质产生能量供维持代谢待续进行。,m:维持系数 g/gg,Y*X/S:生成细胞的干重与完全消耗于细胞生长的基质的质量之比,表示在无维持细胞代谢时的细胞得率
17、,可称为最大细胞得率,46,3、包括产物生成的基质消耗动力学 见p119(1)产物的生成以产能途径进行; 如生产ATP、酒精、乳酸等(2)产物的生成不与或仅部分与能量代谢相关联。,基质消耗速度取决于: (1)细胞生长速率;(2)产物生物速率;(3)基质消耗用于维持能速率。,47,细胞反应动力学模型的建立,细胞反应过程数学模型是一组可以近似描述或表示细胞反应过程的数学方程式,可以在一定程度上精炼出原过程的特征。预测微生物反应过程的进程,成为预测模型。数学模拟放大。可以省去中试阶段,降低费用。缩短开发期。过程优化策略。通过计算机仿真,求出各种条件下生成装置的各种行为,寻找最优生成条件,实现生成的最
18、佳操作。过程优化控制。按照数学模型,求解控制变量的最优值,保证反应某个指标、产品质量或能量消耗处于最佳值。,生化工程中,大致有三种模型:数字拟合型:完全依赖于实验,根据实验数据进行回归分析建立一个能够描述变量外部联系的数学模型机制模型:建立在反应机制基础之上。常规模型:以实验为依据,在模型的数学表达式上对有近似特性的机制模型加以模拟,形式虽然与被模拟的机制模型相似,但模型参数的本质不完全相同。,48,49,一、数学拟合型模型 黑箱系统+经验模型。 不需要了解内部机制,模型值直接应用于生成过程,可靠性较高,但不能找到反应过程的本质。 获取数据的途径: (a)在正常生产操作中获得实测数据; (b)
19、实验设计获得实测数据。例子:(1)紫外线照射菌体悬浮液与细胞存活率关系P123(2)超声波降解透明质酸的时间与透明质酸相对分子时的关系P124,50,二、机制模型 “白箱”系统要求:(1) 对内在机制有深刻的认识;(2)精确、可靠的基础数据。无条件限制下的微生物种群生长P125,51,三、常规细胞反应动力学模型,机制分析,Y=f(x1,x2,xn),获取数据,模型,参数估计,兽疫链球菌分批发酵过程动力学模型推导P126,龙格库塔法:http:/ 介于分批培养与连续培养之间,在发酵的过程中连续或间歇的补加一种或一种以上特定限制性底物,直到反应结束后才排出培养液的操作方式。,补料分批培养主要适用于
20、代谢产物得率或生成速率受底物影响、细胞的生长状况和培养环境需要调节的过程:P130细胞的高密度培养过程所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制作用存在Crabtree效应营养缺陷型菌株的培养受异化代谢阻遏的系统高粘度的培养系统,53,Crabtree效应,Crabtree效应:在酵母培养中,当糖浓度过高,即使溶解氧很充足,酵母菌也会将糖分解成乙醇,从而使菌体得率下降的现象。Crabtree(1929)发现,面包酵母的呼吸活力对游离的葡萄糖十分敏感,当其浓度在5g/L时即出现阻遏作用。为获得最大酵母得率,不能用恒速流加的方法,而保持最大生长速率的变速流加法只是理想状态。,54,55,补料分批发酵过程动
21、力学模型状态变量:表示在任何反应时间上反应情况的一组相互依赖的变量及其数值。 pH、温度、细胞浓度、底物及产物浓度 过程参数:包括细胞的生长速率、得率系数、氧及二氧化碳的传递系数。操作变量:包括加料速率、加料中的底物浓度、搅拌速度及通气速率等。,56,补料分批发酵的状态方程 状态方程与质量平衡与能量平衡有关,因此推导状态方程时要采用平衡关系。推导过程P132,恒速流加操作模型 P133,恒定生长参数的流加模型 P134,定值控制的流加模型P136,57,连续发酵过程动力学,1870年克赫创建的纯种培养技术与1933年克雷文创建的三角瓶震荡液体培养方法为工业化利用微生物技术开辟了新的途径。现代发
22、酵工业中,绝大多数培养均采用纯种液体培养,操作方法主要是间歇培养、连续培养和流加培养。特别是1949年创建的连续培养,保持培养的稳定状态,并能维持较长时间,为研究微生物对环境的响应,寻找培养的最佳条件提供了独特的研究方法,也成为连续生产细胞和其他产物一种极好的培养方法。,58,连续发酵过程指以一定的速度向反应器中流加新鲜培养基,同时以相同的速度排出培养液,因而反应器内的液量维持恒定。纯培养的连续操作主要采用CSTR,根据达到稳定状态的方式不同,CSTR有两种类型:恒化器和恒浊器恒化器无反馈控制机构,以恒定不变的流量供给培养基,通过细胞自身的催化性质达到稳定的操作状态恒浊器有反馈控制机构,通过控
23、制培养基的流加速率,使反应器内的细胞浓度保持恒定。恒浊器较难控制,多采用恒化器进行连续培养。,59,优点:细胞生长速度、代谢活动处于恒定状态,能够高速稳定的大量生产,生产效率高,劳动成本低,产品质量稳定;缺点: (1) 开放式操作导致容易染菌;(2) 有些细胞得不到更新,容易退化变异。,连续反应器的特点,60,恒化器及其操作特征,所谓恒化器,是指具有恒定化学环境的反应器,恒化指明了操作的稳定状态特征。恒化器的基本操作模式如下图。,61,物料连续地以体积流量 F 流入反应器,并以同样流量流出去。流入物流中基质浓度为S0 ,菌浓度为x0 。x0一般为 0,反应器内有很好的混合,即各点浓度一样。,恒
24、化器的操作特点是其流出物流的浓度与反应器内相同,而且加入的物流一进入反应器立即与反应器内物料均匀混合。,对于菌体:,积累的细胞(进入-流出)的细胞 +(生长-死亡)的细胞,从物料衡算关系可以作出菌体的平衡关系:,比死亡速率,比生长速率,若流入反应器的菌体浓度 x0 为零;培养液体积不变;,所以,F/V 实际上是表示单位体积培养液的流率,用稀释率 D 来描述,表示反应器中物料更新程度,是连续培养中的一个重要的参数;稀释速率的倒数就是物料在反应器中的平均停留时间。,开始连续培养一段时间(大约是平均停留时间的3-5倍)以后,微生物反应过程进入稳态,培养液中的细胞、基质和产物浓度恒定,不再随培养时间变
25、化,这就是恒化培养。达到稳态时:,对于恒化器而言,因菌体浓度处于恒定状态,所以:,这表明,在一定范围内,人为地调节培养基的流加速度,可以使细胞按照所希望的比生长速率来生长。,对于限制性底物:,积累底物(流进-流出)-(生长+产物+维持)所消耗的底物,产物形成量很小,可以忽略,这样,在恒定状态下,对于产物形成过程中的平衡:,积累的产物(生成-流出)的产物,同样道理,在恒定条件下:,连续培养中,变量很多,如x、s、D及等,但这些变量中D是最基本的变量,这不仅因为D可以通过加料量F而任意调节,更重要的D一旦变化,就会引起x、s、等一系列变化,直至达到新的稳定状态。,前述的几个平衡式即是单级恒化器在达
26、到平衡时的基本特征,式中均涉及到稀释率。,稀释率与细胞浓度、营养物质浓度之间存在相互关系的关系。,如果D增加,开始x呈线性慢慢下降,然后,当Dmax时, x下降到0;开始时, s随D的增加而缓慢增加,当Dmax时, s si; x 0表示反应器中的菌体通过稀释被“清洗出罐”,此时的稀释率定义为临界稀释率Dc:,教材 6-153、6-155式分别表示了 s 和 x 对培养基流速(也就是 D)的依赖关系:,当流速低,即 D 较小时,营养物质全部被细胞利用, s 0,细胞浓度 x =siYx/s ;,临界稀释率Dc:流出反应器的物料中基质浓度等于流入反应器的物料中的基质浓度,此时的稀释率称为临界稀释
27、率Dc 。Dc是CSTR的操作上限,此时D=。当CSTR达到稳定状态操作时不能超过连续培养系统的临界稀释率。,X,S,DX,D(1/h),X,DX(g/L),S(g/L),DX,1,2,3,4,5,0,0,2,4,6,8,10,D0;x达最大值,s最小。 D增大,s增大,x减少,直至最后x=0,X,S,DX,D(1/h),X,DX(g/L),S(g/L),DX,1,2,3,4,5,0,0,2,4,6,8,10,清洗点 : D max 时,s迅速增大到S0,x迅速下降到0 。,可见,单级恒化器连续培养菌体的稳态操作必须有DDc;如果DDcrit ,反应器中的菌体终将被冲出;如果D只稍微低于Dc,
28、那么整个系统对外界环境的变化是非常敏感的,随D的微小变化,x将发生巨大的变化。,如果连续培养是以菌体为目的产物,那么菌体生长速率希望取得最大值,dx/dt称为连续生产菌体的生产强度Pt,kss0, ,可知Dmax就在max附近,例题1:在一连续操作的搅拌槽式反应器中,用乳糖培养大肠杆菌,反应器的体积为2L ,加入乳糖的初始浓度为160mg/L,如果用不同的加料速度时,结果如下:,求大肠杆菌最大比生长速率m 和Ks。,解题思路:由=D=F/V,求得一定稀释率下的,代入莫诺方程,列出两组方程即可。,m = 0.6 h-1,Ks = 20 mg/L,例题2:连续培养时微生物在葡萄糖中的生长符合莫诺方
29、程,m=0.5 h-1,Ks=0.1g/L,D=0.4 h-1,则在稳态时微生物的比生长速率 为 ,流出物中葡萄糖的浓度为 。,0.4 h-1,0.4g/L,连续培养的应用问题,目前,连续培养只在酵母菌单细胞蛋白(SCP),乙醇生产和污水处理上成功地应用,在其它微生物培养中的应用还很少。 主要原因是: (1)微生物菌种的变异问题。(人工诱变处理的高度变异株,长期的连续培养中容易使恢复突变株逐渐积累,最后取得生长优势) (2)杂菌污染问题。(供给新鲜培养基、供给无菌空气等过程极易带来杂菌污染)(3)产物的高成本分离过程。连续培养可提供微生物代谢的高度选择性的最佳环境,在生产强度、转化率方面具有优势,只要在获取高产物浓度上得到技术突破,便可增进竞争优势,因此,对于工业化生产仍极具潜力。,