1、发酵工程 课件 Fermentation Engineering,第二章 菌种的来源,主讲人：程云清,欢迎,光临,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,2,教学目的：了解工业化菌种的要求以及一些工业化生产菌介绍；了解菌种分离的一般过程；掌握土样采集应注意的问题，菌种的分离方法；掌握优良菌种应具备的基本特性和菌种的选育、种子扩大培养。教学重点、难点：土样采集应注意不同的土壤特点、地理和气候条件，土样的采集方法； 生化反应分离法；种子扩大培养。,第二章 菌种的来源(4学时),2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,3,内 容 速 览,2诱变 育种,2.2目的微生 物的分离
2、,2.1工业化 菌种的要 求及介绍,2.3菌 种选育,1自然 选育,菌种的来源,2.4 种子扩大培养,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,4,一、工业化菌种的要求,1 工业化菌种的要求及已工业化产品生产菌介绍,能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物；,遗传性能要相对稳定；,菌种改造的可操作性要强；,抗噬菌体及杂菌污染能力强；,产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；,发酵条件如温度、pH、溶解氧、泡沫等易控制。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,5,放线菌（链霉素、四环素、红霉素等）,真菌（青霉素、头孢菌素等）,一些产芽孢的细
3、菌（多黏菌素、丁胺菌素等）,植物或动物来源（蒜素、番茄素、鱼素等）,1、抗生素生产有关的微生物,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,二、已工业化产品生产菌介绍,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,6,初级代谢和次级代谢异同？,1 概念不同 2 产物不同 3 存在范围不同 4 对微生物的作用不同 5 同微生物生长过程的关系 6 对环境条件的敏感性或遗传稳定性上明显不同 7 相关酶的专一性不同 8 两者既有区别性又有连续性,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,7,概念不同,在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外界吸收各种营养物质
4、，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程，称为初级代谢 而次级代谢是相对于初级代谢而提出的一个概念。一般认为，次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,8,产物不同,初级代谢的产物，即为初级代谢产物。如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等生命必需物质。 通过次级代谢合成的产物称为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型,
5、2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,9,存在范围不同,初级代谢的代谢系统、代谢途径和代谢产物在各类生物中都基本相同，它是一类普遍存在于各类微生物中的一种基本代谢类型。 次级代谢只存在于某些微生物中，并且代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,10,对微生物的作用不同,通过初级代谢，能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，因此初级代谢产物，通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止，重则导致机体发生突变或
6、死亡，是一种基本代谢类型。 次级代谢产物一般对菌体自身的生命活动无明确功能，不参与细胞结构组成，也不是酶活性必需的，不是机体生长与繁殖所必需的物质，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍，也不会导致机体生长的停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。但许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,11,2、氨基酸生产有关的微生物,用人工诱变的方法，有意识地改变微生物 的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵 形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵 中得到成功应用。,50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业
7、发展历史上的一个转折点。,代谢控 制发酵,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,12,可以大量积累,人工诱变 的菌株不能合成,反 馈 抑 制,不 能 合 成,人工诱变控制黄色短杆菌 的代谢过程生产赖氨酸P459,高丝氨酸脱氢酶,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,13,氨基酸生产菌的要求：,代谢途径比较清楚； 代谢途径比较简单。,谷氨酸发酵的菌种：,其它氨基酸生产菌：,棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌。,常规菌种一般是以谷氨酸生产菌选育而成；大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，工程菌。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,14,3、酶制剂生产
8、有关的微生物,利用微生物来进行酶制剂生产是19世纪日本人用曲霉通过固体培养生产他卡淀粉酶，而大规模工业化生产则始于20世纪40年代末日本用深层发酵法生产淀粉酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等； -淀粉酶：米曲霉、巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌等； 纤维素酶：木霉、青霉； 蛋白酶：黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌等。,2019年7月3日星期三,15,一、菌种分离的一般过程二、微生物材料的标本采集A、不同的土壤特点 B、地理和气候条件 C 、微生物的生理特性 D 、极端环境条件下采样分离 三、标本的预处理四、目的微生物富集的一些基本方法五、菌种分离,2 自然界中目的微生
9、物的分离,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,16,一、菌种分离的一般过程 P14,标本采集, 预处理, 富集培养, 菌种分离（初筛、复筛）, 发酵性能鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大？,如何在后续的操作中使这种可能性实现？,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：, 菌种保藏,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,17,遵循原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种一般通过以下途径获得菌种： 向菌种保藏机构索取有关菌株； 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等； 从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶
10、的产生菌。,二、微生物材料的标本采集,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,18,国内菌种保藏机构27,ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 SIA 四川抗菌素工业研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 C
11、MCC 医学微生物菌种保藏管理中心 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 CIVBP 中国兽医药品监察所 YM 云南省微生物研究所 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心 CMBGCAS 海洋微生物中心 HKUCC 香港大学保藏中心 CUHK 香港中文大学保藏中心 BCRC 台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,19,国外菌种保藏机构,ATCC(American
12、 Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中心 NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心 CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心 UKNCC (The United Kingdom National Culture Collection ) 英国国家菌种保藏中心,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生
13、命科学学院,20,自然界中微生物极其丰富，土壤是微生物最集中的地方，所以土壤样品往往是采集的首选目标。土样采集应注意以下问题：A、不同的土壤特点B、地理和气候条件 C 、微生物的生理特性 D 、极端环境条件下采样分离,二、微生物材料的标本采集,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,21,A、不同的土壤特点P15,因土壤组成、有机物浓度、pH等条件的不同，微生物的种群分布会非常不同。如菜园和农田常以细菌和放线菌较多（偏碱）；果园树根土壤中酵母菌含量较高（偏酸）；动植物残骸及腐殖土中霉菌较多；根瘤菌多在豆科植物根系土壤中分离；分解石油的微生物常在油田和石油炼油厂附近的土层中分布最多。
14、自然环境中的天然菌群，可因人类的生产或生活而改变。如在土壤中加去莠津（2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪 ），会导致放线菌群的增加；在杀真菌剂存在下，诺卡氏菌属的菌更容易分离到。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,22,B、地理和气候条件,南方和北方，一年四季。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方。原因是南方温度高、温暖季节长、雨水多、相对湿度高、植被覆盖面广、土壤有机质丰富。冬季温度低气候干燥；春季温度开始回升但雨水较多；夏季天气炎热温度高；秋季采土样最为理想。采土样的方法：南方，用取样铲，将表层5cm（阳光直射，蒸发量大水分少
15、，而且受紫外线照射）左右的浮土除去，取525cm处的土样1025g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在1030cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,23,C、微生物的生理特性,筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；低温酶产生菌时，南北极地区、冰窑、深海；分离耐压菌则从深海底部采样，如Micrococcus aquivivus水活微球菌,耐600个大气压；分离耐高渗透压酵母菌时，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆
16、积处采样。花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,24,、极端环境条件下采样分离,极端微生物的采集。高热、高压、低温、强碱、强酸及高渗透压等,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,25,三、标本的预处理提高菌种分离的效率 物理方法：加热(55,6min；100,1h；40 2-6h)、膜过滤法、离心法、空气搅拌法化学方法：含1%几丁质培养基、用CaCO3提高pH值进行培养（链霉菌属）诱饵法：用涂石蜡的棒置于碳源培养基中（诺卡氏菌）、花粉（游动放线菌）、蛇皮（小瓶菌属）、人头发（角质菌属）,2019年7月3日星期三,
17、吉林师范大学生命科学学院,26,小瓶菌属,放线菌目、游动放线菌科的一属。已记述约10个种。代表种为规则小瓶菌。 形态特征：一般无气生菌丝，基内菌丝上层栅栏状菌丝或孢囊柄顶端着生瓶状、简形、铃状或略不规则的孢囊，其中有大量呈平行直线排列的杆状孢囊孢子；孢囊孢子大部具极生鞭毛，能游动；细胞壁化学组分型，即以内消旋二氨基庚二酸和甘氨酸为特征组分 ； DNA中的G+C克分子含量为72.3。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,27,富集的基本方法：1、控制营养：如以唯一碳源或氮源作底物；2、控制培养条件：如pH、温度、通气量等；3、抑制不需要的种类。,四、目的微生物富集的一些基本方法,
18、富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使 筛选变得可能。,富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,28,富集培养方法：1、分批式富集培养：指将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复几次后，再取此富集培养物接种至固体培养基上，以获得单菌落。转种是关键。2、恒化式富集培养：通过改变限制性基质浓度，来控制两类不同菌株的比生长速率。,四、目的微生物富集的一些基本方法,2
19、019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,29,五、菌种分离,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基；,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素。,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,30,1、常规分离法：平板划线法、稀释分离法和涂布法,2、生化反应分离法：透明圈法、变色圈法、抑菌圈法、生长圈法。,透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，这样能分解该底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈。,圈的大小可初步反映该菌株
20、利用底物的能力，完全可以作为菌种初筛的判断标准。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶产生菌的分离，产有机酸菌的初筛。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,31,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,32,A 分区划线法 B 连续划线法,吉林师范大学生命科学学院,33,将样品分散到最低浓度,倒平板，培养，挑取单菌落,后面3个稀释度各取0.1 ml涂布,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,34,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,35,例1：分离某种产生有机酸的菌株时，在培养基中添加碳酸钙。,例2：分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳源
21、，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,36,例1：分离果胶酶产生菌，用含0.2%果胶为唯一碳源，菌落长成后加入0.2%的刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现降红色的变色圈。例2：分离内肽酶产生菌，除了用酪蛋白作底物平板产生透明圈进行鉴别外，还可用吲羟乙酸酯为底物加到分离培养基内，产生蛋白酶的菌落由于水解吲羟乙酸酯为3-羟基吲哚，后者能氧化生成蓝色产物，根据变色圈便可选出平板上产蛋白酶菌株。,变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入
22、指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,37,抑菌圈法：若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，被鉴别出来。,抑菌圈自动测量分析仪,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,38,常用于抗生素产生菌的分离。工具菌的选择是关键，工具菌采用抗生素的敏感菌。传统上常用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌作为工具菌检验抗生素的抗性，现采用联合工具菌如枯草芽孢杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌，可分离出抗菌活性低，对其它试验菌活性高的新抗生素，如黄色霉素族的抗生素，而这些抗生素在单
23、独使用枯草芽孢杆菌作工具菌时无法检出。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,39,如，嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品进行保温培养，周围出现生长圈的菌落即为 。,生长圈法：常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等产生菌。其工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株，由于得到所需的营养，凡是目的微生物周围便会出现一个混浊生长圈。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,40,3 菌种选育,目的：,防止菌种退化,解决生产实际问题,提高生产能力,提高产品质量,开发新产品,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,41,（1）菌种细胞的生
24、长活力强；（2）生理性状稳定；（3）纯、具有抗噬菌体感染的能力；（4）稳定高产，与目标产品性质相近的副产物及其他产物少；（5）能采用价格便宜，来源广泛的原料，并且转化效率高。,方法：自然选育、诱变育种、细胞工程育种（杂交育种、原生质体融合育种）、基因工程育种等。,优良的生产菌种应具备的基本特性,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,42,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9,自然突变有两种情况：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。为了保证生产水平的稳
25、定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。,一、自然选育,定义：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,43,自然突变引起的原因,多因素低剂量的诱变效应：指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质的作用引起的突变。 互变异构效应：指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。T、G：酮式或烯醇式C、A:氨基式或亚氨基式。平衡：倾向于酮式或氨基式,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,44,自然选育在工业生
26、产上的意义,意义：自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。虽然其突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。,回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变。,问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,45,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落 (注意形态的观察),发酵试验,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,46,自然选育方法,通过表现形态来淘汰不良
27、菌株；（初筛） 通过目的代谢产物产量的考察；（复筛） 进行遗传基因型纯度试验； 传代稳定性试验。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,47,自然选育方法,通过表现形态来淘汰不良菌株；（初筛） 菌落大小、生长速度、颜色、孢子的形成。用于特征明显的微生物如丝状真菌、放线菌及部分细菌。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,48,例：抗生素菌种选育,一般低产菌的菌落不产生菌丝，菌落多光秃型；生长缓慢，菌落过小，产孢子少；孢子生长及孢子颜色不均匀，产生白斑、秃斑或角变；或生长过于旺盛，菌落大，孢子过于丰富等。 判断高产菌落则根据：孢子生长有减弱的趋势，菌落中等大小，菌落偏
28、小但孢子生长丰富，孢子颜色有变浅的趋势，菌落表面沟纹整齐，多、密且较直；分泌色素或逐渐变浅。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,49,自然选育方法,通过目的代谢产物产量的考察；（复筛）高产菌落摇瓶复筛，考察菌种生产能力的稳定性和传代的稳定性。复筛条件已较接近发酵生产工艺。复筛的菌种应及时进行保藏。厌氧微生物厌氧培养基静置培养。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,50,自然选育方法,进行遗传基因型纯度试验；分离、表观形态进行考察，相似的主要菌落占90%以上。 传代稳定性试验。 斜面传代35次（代）的连续传代，产量保持稳定的菌种用于生产。条件一致。,2019年7
29、月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,51,二、诱变育种 P55,人工利用各种诱变剂诱发基因突变，再通过适当的筛选方法获得所需要的优良菌种的育种方法，称为诱变育种。,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变育种的理论基础是：,基因突变？,紫外线使用时间较久，辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好应用最广泛，研究最多。波长260nm左右(253265)诱变效果最好。 激光和微波作为诱变剂，尚处于摸索阶段。,基因重组？,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,52,化学诱变剂,烷化剂：芥子气（SM）氮芥(NM)，环氧乙烷(EO)，二环氧丁烷（DEB），硫酸二乙酯（DES），甲
30、基磺酸乙酯（EMS），乙基磺酸乙酯(EES)、乙烯亚胺(EL)，三亚乙基三聚氰胺(TEM)，-丙酸内酯，重氮甲烷,N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、二乙基亚硝基胺(DEN) 嵌合剂（移码诱变剂）：吖啶橙、吖啶黄 碱基类似物：5-FU，5-BU 脱氨基诱变剂：亚硝酸,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,53,（一）诱变剂处理过程中几个有关的问题,1、化学诱变剂使用过程的安全性,2、出发菌株的选择,3、诱变剂的选择,4、诱变剂量的选择,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,54,化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能直
31、接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防上污染环境，造成公害。,1、化学诱变剂使用过程的安全性,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,55,NTG(亚硝基胍）是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例用自来水大量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜，洗净。 EMS（甲基硫酸乙酯）是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。,1、化学诱
32、变剂使用过程的安全性,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,56,定义：出发菌株指用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的 试验菌株。, 对菌株产量，形态、生理等情况了解； 生长繁殖快，营养要求低，产孢子多且早； 对诱变剂敏感； 菌株要有一定的生产能力； 多出发菌株：一般采用34个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。,选择出发菌株的要求：,2、出发菌株的选择,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,57,出发菌株及生理状态：真菌、酵母106个/ml，放线菌孢子106107个/ml,细菌108个/ml， 细菌选择对数生长期，真菌和放线菌使用幼
33、年孢子，芽孢细菌也可以用芽孢进行诱变处理。 力求90%以上为单孢子，制菌悬液用生理盐水或缓冲溶液。,2、出发菌株的选择,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,58,3、诱变剂的选择,考虑诱变剂的作用机理，根据实际操作方便或成功的经验；,实践证明并非所有诱变剂对某个出发菌株都是有效的；,诱变剂的诱变作用，还取决于出发菌株的特性及其诱变史。诱变剂作用细胞后，对DNA作用引起突变，但不一定都能形成突变体，原因是菌体为了生存，具有一套自我修复系统。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,59,4、诱变剂量的选择,剂量的大小常以致死率和诱变率来确定。最适剂量是指能够提高正突变
34、株变异频率幅度的诱变剂量。处理剂量大，致死率高，诱变率也会提高，但达到一定程度后，再提高剂量反而会下降；但诱变剂量也不宜过低，否则很难获得所需的正突变株。致死率90% 99.9%（过去） 70%80%（现在）。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,60,（二）诱变剂处理的方式,（1）直接处理：将菌悬液用诱变剂直接处理，然后分离。 （2）生长过程处理：适用于诱变作用强而致死率低的诱变剂，或只在分裂过程中对DNA起作用的诱变剂，如秋水仙素。这些诱变剂一般都直接加入到培养基中，混匀，倒入平皿制成平板后培养，在生长过程中诱发菌体突变。 （3）振荡培养处理：即在摇瓶培养基中加入一定量的诱
35、变剂。菌体随着振荡培养，不断地和诱变剂接触，它们之间的作用远比平板生长过程处理充分得多，所以诱变剂浓度不宜过高。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,61,（三）诱变筛选流程 (致死率、突变率、正变率、高产率、投产率),出发菌种,斜面,或摇瓶培养24h,细菌悬液,稀释涂平板,单孢子悬液,诱变处理,挑取单菌落200个,摇瓶初筛50株,挑出高产斜面,留种保 藏菌种,传种斜面,摇瓶复筛5株,挑出高产菌株,放大罐试验，中试考查,大型投产试验,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,62,诱变筛选过程 中的致死率、突变率、正变率、高产率、投产率,2019年7月3日星期三,吉林
36、师范大学生命科学学院,63,（四）筛选的方法,随机筛选也称摇瓶筛选，具体做法是：将诱变处理后菌体分离到琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一支斜面，然后一支斜面的菌体接入一个三角瓶，放置在摇床上振荡培养，根据所测定产物活性的高低，决定取舍。该法缺点是盲目性大，在突变概率小的情况下，如果菌落挑取少了，很难筛选到理想的突变株。,先平板菌落预筛，再摇瓶振荡培养复筛大量菌落先经过平板预筛，保留5%10%的预筛菌株（约200株），再进行摇瓶培养，复证被筛菌株的重演性，同时从200株中筛选出更高产量的突变株。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,64,此法不仅减少了人力物力，缩短了
37、周期，而且减少了盲目性，提高了筛选效率。通过平板菌落预筛主要是淘汰那些低产菌株，有的是根据菌落形态来淘汰，如红霉素产生菌，若突变株是带色素的，往往是低产株应淘汰；有的是根据生化反应特征来淘汰，如抑菌圈、变色圈、透明圈或其他特异性反应圈。,筛选的关键是选择一定的特征（如菌落特征、生化特征等）去判断所筛选的菌株是我们所需要的突变株。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,65,（五）几种诱变剂的使用方法,新鲜斜面菌种+生理盐水或缓冲液洗下振荡稀释菌悬液取5ml菌悬液无菌培养皿磁力搅拌15W、30cm紫外灯（营养体35min，芽孢10min）照射黑纸包好增殖培养挑单菌落,2、化学诱变（
38、以亚硝酸为例）亚硝酸易分解，故常在诱变前用亚硝酸钠在pH4.5的醋酸缓冲液中生成亚硝酸的方法现配现用。,1、紫外线诱变,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,66,取孢子悬液2ml，加入1ml 0.1mol/L NaNO2溶液和1ml pH4.5醋酸缓冲液，27保温处理若干分钟（如10min）后，取出2ml加到10ml 0.07mol/L pH8.6的磷酸氢二钠缓冲液中，pH下降至6.8左右以后中止诱变。然后稀释涂平板，培养后挑单菌落进行选择。,处理真菌孢子：,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,67,处理细菌,将出发菌株接入5ml肉汤中，于370C振荡培养至对数
39、生长期，离心收集菌体，加入数亳升无菌生理盐水，洗涤一次，离心后菌体悬浮在2.5ml0.1mol/L醋酸缓冲液中（pH4.5），然后加入2.5ml0.1mol/L亚硝酸钠，在370C处理数分钟（如5min）后稀释涂皿，培养后挑取单菌落，选择突变株。,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,68,3、航天育种,所谓航天育种是利用空间环境高真空、微重力和强辐射的特点，在宇宙射线的辐射作用下，使生物的遗传性状发生变异，从而选育出优良品种。1996年以来，国防科工委相继组织了返地卫星和高空气球搭载微生物、动物细胞和植物种子，为微生物的诱变育种提供了新的手段。,2019年7月3日星期三,吉林师
40、范大学生命科学学院,69,神舟七号飞船搭载微生物菌种包括灵芝、平菇、虫草、双孢蘑菇、杏鲍菇、茶树菇6种19管 中国南方航天育种技术研究中心和江西省农科院微生物研究所共同合作，采用航天育种诱变技术培育出的金针菇“航金号”和“航金号”，日前通过专家鉴定。具有抗杂性强、早熟、耐高温、品质好、产量高等特点,3、航天育种,2019年7月3日星期三,吉林师范大学生命科学学院,70,思考题,1、 自然界分离微生物的一般操作步骤？ 2、 从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集富集？ 3、 什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？ 4、诱变育种对出发菌株有哪些要求？5、诱变选育的流程？6、工业上优良生产菌种应具备哪些基本特性？,
