1、第七章 发酵过程控制,发酵过程控制是发酵的重要部分控制难点：过程的不确定性和参数的非线性,了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的。,本章内容,第一节 发酵过程控制概述第二节 温度对发酵的影响和及其控制第三节 发酵过程的pH控制第四节 氧的供需及对发酵的影响第五节 泡沫对发酵的影响和及其控制,第一节 发酵过程控制概述,发酵过程的种类 发酵过程工艺控制的目的发酵过程研究的方法和层次四 发酵过程的中间分析,一 发酵过程的种类,分批培养补料分批培养半连续培养连续培养,1、 分批发酵 简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。 整个过程中菌的浓度、营
2、养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。,分批培养中微生物的生长,迟滞期,对数生长期,稳 定 期,死亡期,分批培养的优缺点,优点： 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握。,缺点： 产率低，不适于测定动力学数据,2、补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。,补料分批培养的优缺点,优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用
3、计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。,缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会。,3、半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。如四环素发酵。,优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。,缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大。,4、连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。,连续培养的优缺点,优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期
4、长，得到高的产量。由于D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学。,缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,二 发酵过程工艺控制的目的,有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来。,目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率。,发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率。菌代谢与环境的相关性 温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等。,发酵过程受到多因素又相互交叉的影响，如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。,因此发酵过
5、程的控制具有不确定性和复杂性。,三 发酵过程研究的方法和层次,1、研究方法,单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性,数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。,但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。,优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单
6、因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。,2、研究的层次初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。,代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较可信。,现在的发酵罐
7、除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧、pH电极，得到发酵全过程的这些参数外，还有罐体称重，补料计量装置和尾气采集分析系统。,鸟苷发酵过程曲线,生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现，达到产业化的实现。,一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致。,四、发酵过程的中间分析,发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化
8、碳，粘度，菌浓度等。,代谢参数按性质分可分三类：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等。,生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等。,化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等。,从检测手段分可分为：直接参数、间接参数,间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等。,直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等。,直接参数又可分为在线检测参数和离线检测参数,离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。,在线检测参数指不经取样
9、直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速、溶解CO2、尾气CO2、黏度等.优点：及时、省力，可从繁琐操作中解脱出来，便于计算机控制。 困难：传感器要求较高。,对传感器的要求能经受高压蒸汽灭菌；传感器及其二次仪表具有长期稳定性；最好能在过程中随时校正，灵敏度好；探头材料不易老化，使用寿命长；安装使用和维修方便；解决探头敏感部位被物料（反应液）粘住、堵塞问题；价格合理，便于推广。,温度测量 感温元件：热电偶（温度信号 电信号） 二次仪表：将热电偶输出的电信号转换成 被测介质的温度,搅拌转速和搅拌功率的测量搅拌转速：磁感应式，光感应式，测速电机；搅拌功率：功率表，测定力矩求功率法
10、。,空气流量测定体积流量型： 会引起流体能量损失，受温度和压力变化的影响； 同心孔板压差式流量计； 转子流量计。质量流量型： 根据流体固有性质（质量、导电性、热传导性能）设计的流量计。,罐压测量 压力表 压力传感器,压力（Pa）影响发酵过程氧和CO2的溶解度，正压防止外界杂菌污染。罐压一般控制在0.21050.5105 Pa。,料液计量与液位控制 压差法：H=（P2/P1）H 直接重量测量法：直接称重 体积计量法：计算进出料液 流量计量法：计算流量和时间 液位探针,发酵液粘度测定 毛细管粘度计 回转式粘度计 涡轮旋转粘度计,pH测量 复合pH电极 pH测量仪器,溶解氧的测量 化学法 极谱法 复
11、膜氧电极法,复膜氧电极示意图（a）极谱型 （b）原电池型,溶解二氧化碳测量 复膜式电极法 渗透膜碳酸氢钠法发酵尾气的在线分析 CO2分析 O2分析,细胞浓度的测量 化学法：如DNA、RNA分析等 物理法：如重量分析、分光光度分析、 浊度分析等新技术：以电容法为测量原理的在线 活细胞浓度测量传感器,原位活细胞在线检测仪,（一）发酵过程主要分析的项目,目前发酵过程主要分析项目如下,1、pH pH与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性,pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况。,2、排气氧、排气CO2和呼吸熵,排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还
12、剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。,RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料,CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量,呼吸熵,呼吸熵反映了氧的利用状况,一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限
13、制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但CER、OUR大幅度提高，连RQ也提高约10，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。,3、糖含量,微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快。通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。,糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、
14、饴糖、单糖等各种糖。 还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。,4、氨基氮和氨氮,氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是 mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。,氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。,5、磷含量,微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的组成部分，是高能化合
15、物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。,6、菌浓度和菌形态菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态 显微镜观察,菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。,菌浓测定方法测粘度压缩体积法（离心）静置沉降体积法光密度测定法 OD600660 适合于细菌、酵母,7、氧化还原电位（mV）培养基的氧化还原电位是影响微生物生长及生化活性的因素之一。在某些限氧发酵（如氨基酸），氧电极以不能精确使用，氧化还原电位参数控制较为理想。,8、
16、产物浓度,在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成的影响。,(二) 产物量的测定,1、抗生素效价的表示,抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示,效价表示方法：重量折算法 重量单位 类似重量单位 特殊单位,重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克1U,重量单位：规定某些抗生素活性部分1g=1u 如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分1g1u,类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=100
17、0u如金霉素、四环素的盐酸盐定一为1g1u,特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉菌素 1mg=3700u多粘菌素B 1mg=10000u,2、酶活力的表示法,酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成混乱，为此国际上作了统一规定.,3、化学法,（1）滴定法产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法。如青霉素在碱性条件下加入过量的I2，反应生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可计算出青霉素的单位。,柠檬酸可以用NaOH滴定来计算柠檬酸产量,（2）比色法产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成
18、正比，可以用比色法测定。,淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。,（3）测压法 产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。,谷氨酸,氨基丁酸CO2,4、物理法 许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。,化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析.缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生素成品的测定用生物法测定。,适用于抗生素效价的测定，采用杯碟法。 生物法以抗生素
19、的杀菌能力为衡量效价的标准，其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。 但此法得到结果比较慢，需经过1618小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。,5、生物法,r: 抑菌圈的半径(毫米）M：抗生素在管中的量（单位）C：最低抑菌浓度（单位/毫升）H：培养基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的扩散系数（毫米/小时）T：细菌生长到肉眼所用的时间 （小时）,第二节 温度对发酵的影响和及其控制,微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。,一、温度对生长的
20、影响,不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长 。,每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。,在最适温度下，微生物生长迅速；,超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；,在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。,在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。,微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于
21、最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。,二、温度对发酵的影响与控制,（一）温度对发酵的影响,1、温度影响反应速率,发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 积分得 E=,E活化能,Kr速率常数,K与温度有关E越大温度变化对K的影响越大,温度对青霉菌生长速率、呼吸强度和青霉素生产速率的影响如上图所示。可以看出，温度对参与生长繁殖、呼吸和青霉素形成的各种酶的影响是不同的。,青霉菌： 生长 E=34 kJ/mol 呼吸 E=71 kJ/mol 产物合成 E=112 kJ/mol 青霉素形成速率对
22、温度最为敏感，偏离最适温度引起的生产率下降比其他两个参数的变化更为严重。,活化能E反映温度变化对酶反应速率的影响,2、温度影响发酵方向,四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。,金色链霉菌,3、 温度基质溶解度,影响氧在发酵液中的溶解度 温度 溶氧影响基质的吸收速率 如菌体对硫酸盐吸收在25时最小,（二）最适温度的选择,所谓最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的合成。对不同的菌种、不同的培养条件、不同的酶反应以及不同的生长阶段，最适温度有所不同。
23、,（二）最适温度的选择,1、根据菌种及生长阶段选择,微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。,如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C，青霉菌生长温度为300C。,在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；,根据生长阶段选择,在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。,发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物
24、合成到放罐。,如四环素生长阶段28 ，合成期26 后期再升温；黑曲霉生长37 ，产糖化酶3234 。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长3032 ，产酸3437。,最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。,例：林可霉素发酵的变温培养,问题的提出接种后10h左右已进入对数生长期，随后是10h左右的加速生长期，在40h左右对数生长期基本完成，在50h左右转入生产期主要问题：如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在.,根据生长阶段选择温度,变温培养的正交设计,结论：前60h按31控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产
25、阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础60小时后将罐温降至3O使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素发酵进入后期罐温再回升至31 使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。,2、根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。,培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。,3、根据菌生长情况,菌生长快，维持在较高温度时间要短些；,菌生长慢，维持较高温度时间可长些。,培养条件适宜，如营养丰富，通
26、气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。,总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,三、发酵过程引起温度变化的因素,（一）发酵热Q发酵,发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。,什么叫净热量呢？,在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。Q发酵 = Q生+ Q搅拌-Q蒸发-Q显- Q辐射,这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。 Q发酵 = Q生+ Q搅拌-Q蒸发-Q显- Q辐射,发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。,
