1、1转基因大豆的检测实验设计生物技术安全评估 092012 年 5 月2目录前言3.实验一 大豆样品的准备 4实验二 大豆 DNA 的提取和纯化 4实验三 靶标基因的扩增 6实验四 反应产品检测 10实验五 结果分析 12参考文献123前言随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（Genetically Modified Organism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。抗草甘膦（glyphosate）大豆（商品名，roundup ready soybean）是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗
2、草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。基于核酸的检测技术主要有PCR 方法和基于PCR 原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR 等等。普通PCR 方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003 年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。这些标准涉及的转基因作物有大豆（SN/T 1195-2003）、玉米(SN/T 1196-2003)、棉花(SN/T 1199-2003)、油菜籽(SN/T 1197-2003)、烟草(SN/T 1
3、200 -2003) 和马铃薯(SN/T 1198 -2003)。目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。随后在2004 年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T 19495.4-2004)， 该国标中用的方法还是普通PCR。因此，普通PCR 方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。本实验以三种大豆为材料进行比较，通过对其DNA的提取和纯化，4靶标基因的获取及琼脂糖电泳分析，从而鉴定所检测大豆样品。采用PCR检测转基因大豆的方法，主要是采用琼脂糖凝胶电泳法，首先检测CAMV-35S启动子进行筛选，然后检测EPSPS抗草甘膦基因。5实验一 大豆样品的准备一 样品来源：（原始样品最小质量为：
4、11200 克）1、 阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质（IRMM-410R，Fluka 公司）2、 进口转基因大豆样品3、 非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。二 样品加工过程：1、 构成原始样品（原始样品不得低于试验样品的 4 倍）2、 样品的初步处理（去皮、去壳、除水、除油等应记录初步处理前后样品的质量变化）3、 破碎和研磨4、 缩分5、 实验室样品的制备（实验室样品的最小质量不能小于原始样品最小质量的 1/16）6、 存查样品和式样的制备实验二 大豆 DNA 的提取和纯化（CTAB 法）一 实验目的掌握用 CTAB 法提取真核细胞总 DNA 的原理、步骤和注意事项。二 实验原理1、
5、 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB 溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。2、 CTAB 提取缓冲液各成分的作用：（1）Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏（2）ED
6、TA 螯合 Mg2+或 Mn2+离子,抑制 DNase 活性（3）NaCl 提供一个高盐环境,使 DNP 充分溶解,存在于液相中（4）C-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因 组 DNA（5）主要作用物质就是氯仿，所以它占有的比例较大，而异戊醇的主要就是防止起泡 泡。6三 实验仪器和实验试剂1.仪器：水浴锅 离心机 EP 管 电泳仪 研钵2.试剂: 去离子水 乙醇 氯仿-异戊醇 液氮CTAB 缓冲液 ：CTAB 20g/L，Tris-HCI 0.1 mol/L(pH8. 0)， EDTA 0.02 mol/L.TE 缓冲液：lo mmol/L Tris.，1 m
7、mol/I, EDTA， pH8.0). 酶溶液：5g/l.材料：阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质（IRMM-410R，Fluka 公司）、进口转基因大豆样品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。四 实验步骤（三种材料分别进行）1、洗干净大豆叶片，用 75%的酒精表面消毒 3min, 用去离子水冲洗 34 次2. 称取 1g 叶片放入灭过菌的研体中，加入液氮捣碎，迅速转入 2ml 离心管中。3. 加入 600l CTAB 缓冲液，震荡均匀，65温育 30min.4. 加入 500ul 酚：三氯甲烷：异戊醇（25:24:1），振荡均匀，12000r/min， 离心15min。5. 吸取上清
8、液，放入另一新管中，加入等体积的异丙醇，12000r/min，离心 10min。6. 弃去上清液，加入 70%乙醇溶液洗涤，12000r/min，离心 1min。7. 弃去上清液，干燥，用 50l TE 溶液溶解沉淀。8. 加入 5l RNA 酶溶液，37温育 30min。9. 加入 400l 的 CTAB 溶液，振荡均匀。10. 加入 250l 的三氯甲烷：异戊醇，振荡均匀，12000r/min，离心 15min。11. 吸取上清液，放入另一个新管中，加入 200l 的异丙醇，12000r/min， 离心 10min。12. 弃去上清液，干燥，用 50l TE 缓冲液溶解沉淀。五 实验结果获
9、取大豆的 DNA。六 注意事项1. 研磨组织块用于 DNA 提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70的冰箱中保存。2. 整个抽提过程，要尽量避免 DNA 酶的污染，全程配戴一次性手套，皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染 DNA 的抽提并成为 DNA 酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯，预防微生物污染。7本实验亦可用试剂法。 （takara 公司：首页-产品分类目录 -DNA Extraction Kit for GMO Detection）实验三 靶标基因的扩增一 大豆内源基因 lectin 的检测1、范围本方法规定了大豆物种特异性单拷贝基
10、因序列的常规检测程序。本方法适用于评价从大豆加工产品中提取的 DNA 质量，并可判断是否有足量的 DNA 用于基因成分检测。2、原理通过 PCR 扩增的凝胶电泳分离可得到大小为 118bp 的大豆 Lectin 基因片段。3、检测下限本方法能检测 0.1ng 的大豆 DNA。4、试剂 一般要求按照 GB/T 19495.12004 的要求执行。水10 X PCR 缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP 溶液：各 2.5 mmol/L.引物：A、正向引物大豆 Lectin 基因（GeneBank 编号：K00821）5-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC
11、 C-3B、反向引物大豆 Lectin 基因（GeneBank 编号：K00821）5-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3Taq 酶：5 IU/L5、仪器：PCR 仪、 电泳仪6、PCR 扩增PCR 反应体系本方法中中，PCR 反应的总体积为 25L ，反应体系见表 A.1。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。表(A?) B.1 PCR 反应体系试剂 终浓度 加样体积/ L样品 DNA 10 ng50 ng 1水 15.910xPCR 缓冲液（不含氯化镁）1x 2.58氯化镁溶液（25 mmol/L） 1.5 mmol/L 1.5dNTP 溶液（10
12、mmol/L） 0.8 mmol/L 2正向引物（5 mol/L） 0.2mol/L 1反向引物（5 mol/L） 0.2mol/L 1Taq 酶（5 IU/L） 0.5 IU 0.1注：如 PCR 缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为 1.5 mmol/L.PCR 反应参数PCR 反应参数见表 A.2。使用不同的 PCR 仪，可对参数作适当地调整。表 B(A?).2 PCR 反应参数预变性 10min，95C扩增 20s，95C40s，60C40s，72C循环数 40最终延伸 3min， 72C7、结果判断如果 PCR 产物通过电泳确证，可表述样品 DNA 溶液中含有
13、来源于大豆的可扩增的 DNA。二 转基因大豆 DNA(CaMV 35S 启动子)筛选检测方法1、范围本方法规定了 CaMV 35S 启动子不同拷贝数的定性 PCR 检测方法。本方法适用于转基因大豆 CaMV 35S 启动子的筛选检测。2、原理通过 PCR 扩增的凝胶电泳分离可得到大小为 195bp 的 CaMV 35S 启动子基因片段。3、检测下限本方法未确定绝对检测下限。相对检测下限可以检测含有 0.1% (质量分数) 转基因抗草甘磷大豆粉(IRMM-410)。4、试剂 一般要求按照 GB/T 19495.12004 的要求执行。水10 X PCR 缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mm
14、ol/L.dNTP 溶液：各 2.5 mmol/L.引物：A、正向引物CaMV 35S 启动子（GeneBank 编号：V00141）5-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-39B、反向引物CaMV 35S 启动子（GeneBank 编号：V00141）5-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3Taq 酶：5 IU/L限制性内切酶 Xmn I （=Asp 700）5、仪器：PCR 仪、电泳仪6、PCR 扩增PCR 反应体系本方法中中，PCR 反应的总体积为 25L ，反应体系见表 B.1。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。表 B.1 PCR 反应
15、体系试剂 终浓度 加样体积/ L样品 DNA 10 ng50 ng 1水 15.910xPCR 缓冲液（不含氯化镁）1x 2.5氯化镁溶液（25 mmol/L） 1.5 mmol/L 1.5dNTP 溶液（10 mmol/L） 0.8 mmol/L 2正向引物（5 mol/L） 0.2mol/L 1反向引物（5 mol/L） 0.2mol/L 1Taq 酶（5 IU/L） 0.5 IU 0.1注：如 PCR 缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为 1.5 mmol/L.PCR 反应参数PCR 反应参数见表 B.2。使用不同的 PCR 仪，可对参数作适当地调整。表 B.2
16、PCR 反应参数预变性 10min，95C扩增 20s，95C40s，54C40s，72C循环数 40最终延伸 3min， 72C7、结果判断如果具备下列条件，就能确定检测到目标序列：PCR 扩增产生 195 bp 的 DNA 片段；经过序列分析，未知样品 PCR 扩增条带的 DNA 序列与阳性对照 DNA 序列一致；用限制性内切酶 Xmn I 酶切 PCR 产物产生 115 bp 和 80 bp 两个片段；三 抗草甘膦除草剂基因的检测101、范围本方法规定了在原料中加工产品中检测转基因抗草甘膦除草剂（Roundup ReadyTM）大豆的定性 PCR 方法。本方法适用于对原料和加工产品中转基
17、因成分检测，不适用与对基因堆积品种的转基因成分检测。2、原理通过 PCR 扩增的凝胶电泳分离可得到大小为 172bp 的 DNA 片段，包括CaMV 35S 启动子和矮牵牛叶体运输肽部分序列。3、检测下限根据每个基因组中的结构基因是 1 个拷贝和每个基因组的大小为 1.13X109bp的假设，PCR 检测绝对下限为 50ngDNA，相当于 40 个基因组。4、试剂 一般要求按照 GB/T 19495.12004 的要求执行。水10 X PCR 缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP 溶液：各 2.5 mmol/L.引物：A、正向引物CaMV 35S 启动子（GeneBan
18、k 编号：V00141,J02048）5-TGA TGT GAT ATC TCC ACT GAC G-3B、反向引物矮牵牛叶绿体运输肽基因（GeneBank 编号：M21084，J03227）5-TGT ATC CCT TGA GCC ATG TTG T -3Taq 酶：5 IU/L杂交探针5-GGG TCT TGC GAA GGA TAG TG -3预杂交溶液5xSSC，0.1%N-月桂酰肌氨酸（质量浓度） ，0.2%SDS（质量浓度） ，1%终止液。杂交溶液在 2.5mL 预杂交溶液中加入 10pmol 杂交探针。杂交反应的温度为 50摄氏度。5、仪器：PCR 仪、电泳仪6、PCR 扩增P
19、CR 反应体系本方法中中，PCR 反应的总体积为 25L ，反应体系见表 C.1。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。表 C.1 PCR 反应体系试剂 终浓度 加样体积/ L样品 DNA 10 ng50 ng 1水 15.91110xPCR 缓冲液（不含氯化镁）1x 2.5氯化镁溶液（25 mmol/L） 1.5 mmol/L 1.5dNTP 溶液（10 mmol/L） 0.8 mmol/L 2正向引物（5 mol/L） 0.2mol/L 1反向引物（5 mol/L） 0.2mol/L 1Taq 酶（5 IU/L） 0.5 IU 0.1注：如 PCR 缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化
20、镁在反应混合液的终浓度应调整为 1.5 mmol/L.PCR 反应参数PCR 反应参数见表 A.2。使用不同的 PCR 仪，可对参数作适当地调整。表 C.2 PCR 反应参数预变性 10min，95C扩增 20s，95C40s，60C40s，72C循环数 40最终延伸 3min， 72C7、结果判断如果具备下列条件，就能确定检测到目标序列：PCR 扩增产生 172bp 的 DNA 片段；杂交实验确证，DNA 探针能够特异性杂交 PCR 产物；经过序列分析确证，未知样品 PCR 扩增条带的 DNA 序列与阳性序列一致；根据以上反应条件分别进行以下操作：1、 对三种来源的大豆 DNA，顺序为：阳性
21、转基因大豆产品、进口转基因大豆、普通大豆样品，分别标记为：1、2 、3 号和不加样品 DNA 的空白对照组标记为 11 号，进行 CaMV 35S 启动子的 PCR 扩增；2、 对三种来源的大豆 DNA，顺序为：阳性转基因大豆产品、进口转基因大豆、普通大豆样品，分别标记为：4、5 、6 号和不加样品 DNA 的空白对照组标记为 12 号，进行抗草甘膦基因 PCR 扩增；3、 对三种来源的大豆 DNA，顺序为：阳性转基因大豆产品、进口转基因大豆、普通大豆样品，分别标记为：7、8 、9 号和不加样品 DNA 的空白对照组标记为 13 号，进行 lectin 基因 PCR 扩增。准备好 TaKaRa
22、 DNA Marker:DL500.本实验亦可用试剂法。 （Takara 公司：首页-产品分类目录 -PCR Screening Kit for GM Soybean Ver.2.0）实验四 反应产品检测一 实验目的121、 掌握琼脂糖电泳的基本技术。2、 了解琼脂糖凝胶电泳的原理。二 实验原理琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据 DNA 分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙
23、锭(EB)或 EB 替代物可与 DNA 分子形成EB-DNA 复合物在紫外光照射下发射荧光，其荧光强度与 DNA 的含量成正比。据此可粗略估计样品 DNA 浓度。三、 仪器与试剂1、 仪器：电泳仪、微波炉2、 试剂：凝胶回收试剂盒、TAE Buffer、电泳上样缓冲液、EB 替代品四 实验步骤1、取 30 mL TAE 缓冲液加入三角瓶后，加 0.3 g 琼脂糖，使琼脂糖含量为 1%(质量体积比)2、胶液的制备：将上述混合物放入或电炉上加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。待混合物冷却至 50-60时，加入一定量的 EB 替代物3、胶板的制备：将胶槽置于水平支持物
24、上，插上样品梳子。然后将 2 中的混合物趁热倒入胶槽中，倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子（一般 20min 左右即可） 。然后将胶块轻轻取出，放到电泳槽中（注意摆放的方向，上样孔在负极端，因为 DNA 双螺旋的骨架是由磷酸残基和脱氧核糖组成，而磷酸带负电荷，使得 DNA 带负电） ，使 TAE 缓冲液浸没胶块4、上样：首先在第 1 和第 11（14）泳道加入 marker（即 DL500）,然后根据实验三中三种不同的检测项目（即 CaMV 35S 启动子、抗草甘膦基因、lectin 基因的扩增）可分为三组，具体泳道标号为：2、3、4
25、；5、6、7；8、9、10.即每组三个泳道，泳道顺序统一为：阳性转基因大豆样品、进口转基因大豆样品、非转基因大豆。另分别在 11、12、13 泳道上样CaMV35S 启动子、抗草甘膦基因、Lectin 基因检测组的空白对照。所有样品（20L）与 5L 6buffer 混匀，小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换 tip 头，以防止互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿135、跑电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。恒流，100mA，电泳至指示剂跑到胶的 1/2 处即可停止（一般大概需 30min）6、紫外灯下看电泳结果五 实验结果观察紫外光下是否有电泳 DNA
26、 条带的出现六 实验讨论分析结果及其说明了什么七 注意事项1、 倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡，待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。2、 待胶完全凝固后拨出梳子，然后向槽内加入 TAE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面时，因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。3、注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。4、煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶的 1/3，否则易溢出。实验五 结果分析把经过 CTAB 法提取纯化得到三种大豆细胞总 DNA 根据检测项目的不同可均分成三组，每组
27、顺序统一为：阳性转基因大豆样品、进口转基因大豆样品、非转基因大豆。分别进行PCR 扩增检测。泳道 1 和泳道 11（14）为加入的 marker。DL500 DNA Marker 为已含有 1 Loading Buffer 的 DNA 溶液，可取 5 l 直接电泳。DL500 DNA Marker 由 DNA 片段 500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、150 bp、100 bp、50 bp 组成，共 7 条带。每次取 5 l 电泳时，每条带的 DNA 量约为 50 ng，其中200 bp 的 DNA 片段量约为 150 ng，显示亮带。泳道 2、 3、4 是三种大豆基于 C
28、aMV 35S 启动子（35S 启动子大小为：195bp）的检测，检测为阳性时，则结果应该是在 marker200bp 附近出现条带，由于泳道 2 和 3(4?)分别为转基因阳性大豆和普通非转基因大豆，因此泳道 2 在 200bp 附近出现条带而泳道 4 在相应位置不出现条带。泳道 3 在 200bp 附近是否出现条带则直接证明进口转基因大豆样品是否含有 CaMV 35S 启动子。鉴于绝大部分转基因植物都含有 CaMV 35S 启动子，若检测结果为阳性则说明检测的进口转基因大豆确为转基因，反之则为非转基因。本组主要进行大豆样品的初步定性是否为转基因。泳道 5、6、7 是三种大豆样品基于外源基因
29、的检测，由于绝大部分转基因大豆都转入抗草甘膦基因，当待检测样品为阳性时，则在 200bp 和 150bp 之间（抗草甘膦基因大小为：172bp）出现条带。这一个项目的检测可以进一步确定该转基因大豆的品种。由于泳道 5 是阳性转入抗草甘膦基因大豆，而泳道 7 为非转基因大豆，则泳道 6 相应位置是否出现条带可判断该进口转基因大豆是否为该品种转基因大豆。14泳道 8、9、10 是三种大豆样品基于大豆内源基因（lectin）的检测，当待基因检测为阳性时，则在 100bp 附近出现条带（lectin 基因大小为：118bp） 。检测此项目的原因是保证检测的三种样品为大豆品种，而非其他物种，这在进行转基
30、因制品时尤其有用。泳道 11、12、13 为空白对照组，理想情况下不出现条带。条带的出现表明假阳性、假阴性，因实验操作过程不当出现污染，会影响实验结果的真实性、有效性。参考文献：1中华人民共和国国家标准 GB/T 19495.4-20042 International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications. Global GM crop area continues to grow and exceeds 50 million hectares for first time in 2001IP/TT. http:/ww
31、w.isaaa.org/press%20release/Global%20Area_Jan2002.htm 3 Bertolini E, Olmos A, Martinez MC, et al. Single-step multiplex RT-PCR for simultaneous and colourimetric detection of six RNA viruses in olive treesJ. J Virol Methods, 2001, 96(1): 33 41.4 贺艳,郑文杰,刘烜，赵卫东. 转基因检测技术的研究进展J.食品研究与开发,2009,30（3）：170-1725 中华人民共和国国家标准：大豆中转基因成分的定性 PCR 检测方法（SN/T 1195-2003）
