1、 题 目： 生化分离工程实验 姓 名： 司 仿 学 号： 100820042 学 院： 生物科学与工程学院 专 业： 发酵工程 年 级： 2010 指导教师： 陈剑锋 2010 年 12 月 12 日1生化分离工程实验栀子黄色素的提取、纯化和测定一、实验目的1. 了解栀子油活性成分的 CO2 超临界脱除和有机溶剂脱除工艺的异同点。2. 了解栀子黄色素的乙醇提取和水提取工艺的异同点。3. 掌握栀子黄色素成分的分离纯化原理。4. 掌握栀子黄色素成分的含量测定方法。5. 了解栀子黄色素成分的稳定性测定方法。二、实验基础栀子黄色素是从栀子果实中提取的自然界唯一存在的水溶性类胡萝卜素类天然色素，主要成分
2、是藏花素和藏花酸，成品中还可能存有熊果酸等三帖酸成分、栀子苷和绿原酸。粗加工的栀子黄色素往往因为在保藏或使用过程发生褪色或绿变，其主要原因是色素中大量栀子苷和绿原酸的存在，实践证明，如果能够把色素的OD 238/440比值降低到0.4以下，即能够较好的解决这一问题。栀子黄色素在欧美、日本等发达国家颇受欢迎，国际需求量以年均10%的速度在增长。2000年日本的需求量为320 t，在日本天然色素市场中排位第4，栀子黄色素（A 238/A440 0.40）的售价为4500日元/kg。本实验通过对高色价栀子黄色素的提取工艺及其稳定性进行系统研究，旨在培养学生的实验设计和解决实际难题的能力。为开发利用天
3、然色素新资源- 栀子植物提供参考依据。三、实验材料和仪器1 材料与方法1.1 材料与仪器栀子鲜果购自福建省福鼎市医药公司。藏花素标准品（纯度99%） ，美国Sigma公司。栀子黄色素标准品（色价E 1%1cm = 258.33/mg，A 238/A440 0.38， A320/A440 0.12） ，福州大学中药现代化工程研究室通过层析方式制备。栀子苷、绿原酸和熊果酸标准品（批号分别为0749-200410、0753-200212和0742-200415，纯度均 99% ） ，中国药品生物制品检定所。乙醇、盐酸、硫酸、氢氧化钠、过氧化氢等，均为分析纯，购自广东西陇化工厂。95%食用酒精，市售产
4、品。UV-1700 型紫外分光光度计，日本津岛公司；HH-4 型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。四、实验方法1 栀子黄色素的乙醇提取或自来水提取秋季收获的栀子鲜果 迅速干燥进行降低水分和钝化酶活处理 机械脱壳 果仁破碎至24目左右 CO2超临界脱油 或有机溶剂脱油 加入 6倍量50乙醇溶液或者自来水于75浸2提120 min 10000 r/min离心过滤除杂 滤液取样测定栀子黄色素、栀子苷、绿原酸含量 滤液经真空浓缩脱醇 喷雾干燥成粉（工业化生产）或冷冻干燥成粉（实验室制备） 色素粉末粗品 分装胶囊后于4保存，用于后续栀子黄色素的大孔吸附树脂富集纯化、理化性质评价和稳定性测定。2.1 栀子
5、黄色素的大孔吸附树脂静态富集纯化 称取 HZ801 大孔吸附树脂 30 ml，10% 色素粗品水溶液 100 ml 置于摇床中，100 rpm 下室温振荡吸附 4 h，每隔 0.5 h 取样测定其上清液中栀子黄色素、栀子苷含量，绘制各组分的吸附时变曲线（饱和吸附量以 30 mg/ml 计） 。吸附色素的 HZ801 大孔吸附树脂 加入 3 倍量的 50乙醇溶液，置于摇床中，100 rpm 下室温振荡解吸 4 h 每隔 0.5 h 取样测定其上清液中栀子黄色素、栀子苷含量，绘制各组分的解吸时变曲线。收集富含栀子黄色素部分 收集液经真空浓缩脱醇（ 6070，- 0.095 Mpa）至 1/10 体
6、积 喷雾干燥成粉（工业化生产）或冷冻干燥成粉（实验室制备） 。2.2 栀子黄色素的大孔吸附树脂动态富集纯化 称取 HZ801 大孔吸附树脂 15 ml 置于玻璃层析柱中 10%色素粗品水溶液 100 ml 以 1.0 BV/h 流速上柱，每隔 0.5 h 取样测定其上清液中栀子黄色素、栀子苷含量，绘制各组分的吸附时变曲线（饱和吸附量以 30 mg 色素/ml 计） 。吸附色素的 HZ801 大孔吸附树脂 先用 2 BV 去离子水冲去树脂颗粒间的残留液 再用3 倍量的 50乙醇溶液，以 34 BV/h 流速洗脱 每隔 5 min 取样测定其上清液中栀子黄色素、栀子苷含量，绘制各组分的解吸时变曲线
7、。收集富含栀子黄色素部分 收集液经真空浓缩脱醇（ 6070，- 0.095 Mpa）至 1/10 体积 喷雾干燥成粉（工业化生产）或冷冻干燥成粉（实验室制备） 。3 栀子黄色素的吸收光谱及色素成分的测定室温下，将栀子黄色素粉末产品溶于水配成一定浓度的栀子黄色素水溶液，用分光光度计在200600 nm波长范围内进行扫描，进行吸收峰实验，结果示于图。栀子黄色素的A 238/A440值和A 320/A440值采用紫外分光光度计测定。配制 1%的栀子黄色素溶液，稀释至一定浓度后，用1 cm光径的比色皿，在紫外分光光度计上扫描，测定440 nm、320 nm和238 nm波长处的吸光度值，计算 A238
8、/A440值和A 320/A440值，色价用E 1%1cm表示。4 栀子黄色素理化性质和稳定性测定定量取色素粉末产品，按食品添加剂栀子黄（GB7912-2005）标准所述方法，测定水溶性、A238/A440 和 A320/A440 值（E 1 1cm 表示）等理化指标和在光、热、氧化剂、还原剂、酸、碱、金属离子、食品添加剂条件下的稳定性指标。4.1 pH值对色素稳定性的影响室温下，用不同缓冲溶液控制溶液的pH 值，配制一系列相同色素浓度的栀子黄溶液，分光光度计分别测定其吸光度，结果示于表。4.2 温度对色素稳定性的影响3取10 mL相同色素浓度、相同pH 值的溶液（1%的栀子黄色素溶液、pH
9、46） ，分别于4100恒温水浴保存6 h后测定其吸光度，结果示于表。4.3 氧化剂对色素稳定性的影响室温下，取20 mL相同色素浓度的溶液（1% 的栀子黄色素溶液） ，分别加入不同浓度的30%过氧化氢，在室内光源照射下放置，定期测定吸光度。五、实验数据处理与分析GYP（mg/ml）（ OD440稀释倍数）/55.736GP（mg/ml ）=（OD 238稀释倍数）/30.8191 栀子黄色素的大孔吸附树脂静态富集纯化1.1 栀子黄色素及栀子苷的静态吸附表 1 静态吸附数据记录及处理时间/h 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 稀释倍数 2000 2000 1000 1
10、000 1000 500A238 0.254 0.212 0.416 0.390 0.352 0.741 GPGP mg/ml 16.48 13.75 13.50 12.65 11.42 12.02 稀释倍数 1000 500 500 500 500 250A440 0.158 0.289 0.234 0.196 0.161 0.250 GYPGYP mg/ml 2.83 2.59 2.10 1.76 1.44 1.12 时间/h 3.00 3.50 4.00 4.50 5.50 6.00 稀释倍数 500 500 500 500 500 500A238 0.711 0.685 0.670 0
11、.630 0.610 0.610 GPGP mg/ml 11.53 11.11 10.87 10.22 9.90 9.90 稀释倍数 250 100 100 100 50 50A440 0.214 0.409 0.350 0.270 0.426 0.383 GYPGYP mg/ml 0.96 0.73 0.62 0.48 0.38 0.34 0.03.06.09.012.015.018.00.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0时 间 /hGP mg/ml0.00.51.01.52.02.53.03.5GYP mg/mlGP GYP图 1 GP 及 GYP 的静态吸附曲线静态吸附
12、工艺计算：GP 静态吸附量=(C 吸附前 -C 吸附后 )V 样液 /V 树脂 =(16.48-9.90)100/30=21.93 mg/mL 树脂4GYP 静态吸附量=(C 吸附前 -C 吸附后 )V 样液 /V 树脂 =(2.83-0.34)100/30=8.30mg/mL 树脂1.2 栀子黄色素及栀子苷的静态解吸表 2 静态解吸数据记录及处理时间/h 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50稀释倍数 100 200 300 400 500 500 500 500 500 500A238 0.773 0.639 0.576 0.57
13、4 0.502 0.494 0.498 0.530 0.541 0.506GPGP mg/ml 2.51 4.15 5.61 7.45 8.13 8.00 8.07 8.61 8.76 8.21稀释倍数 50 50 50 100 500 500 500 500 500 500A440 0.124 0.247 0.316 0.714 0.155 0.150 0.135 0.155 0.158 0.150GYPGYP mg/ml 0.11 0.21 0.28 1.29 1.41 1.35 1.28 1.39 1.42 1.340.02.04.06.08.010.00.0 1.0 2.0 3.0 4
14、.0 5.0时 间 /hGP mg/ml0.00.51.01.52.0GYP mg/mlGP GYP图 2 GP 及 GYP 的静态解吸曲线静态解吸工艺计算：GP 静态解吸率=(C 解吸后 -C 解吸前 )V 解吸液 /V 树脂 /树脂吸附量100%=(8.21-2.51)90/30/21.93100%=78.00%GYP 静态解吸率=(C 解吸后 -C 解吸前 )V 解吸液 /V 树脂 /树脂吸附量100%=(1.34-0.11)90/30/8.30100%=44.50%2 栀子黄色素及栀子苷的大孔吸附树脂动态富集纯化2.1 栀子黄色素及栀子苷的动态吸附表 3 动态吸附数据记录及处理时间/h
15、 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4稀释倍数 50 50 100 100 100 200 1000A238 0.224 0.250 0.281 0.390 0.744 0.602 0.598GPGP mg/ml 0.36 0.41 0.91 1.27 2.41 3.90 19.43稀释倍数 1 50 50 50 50 50 50A440 0.150 0.105 0.170 0.174 0.190 0.174 0.182GYPGYP mg/ml 0.002 0.09 0.15 0.16 0.17 0.16 0.16时间/h 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5稀释倍数 1000 200
16、0 2000 2000 2000 3000 3000A238 0.650 0.707 0.756 0.666 0.707 0.580 0.591GPGP mg/ml 21.07 45.96 49.16 43.96 45.88 56.56 57.535稀释倍数 50 50 50 50 50 50 200A440 0.180 0.184 0.184 0.219 0.249 0.770 0.493GYPGYP mg/ml 0.16 0.17 0.17 0.20 0.22 0.69 1.770.010.020.030.040.050.060.00 1 2 3 4 5 6 7 8时 间 /hGP mg/
17、ml0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0GYP mg/mlGP GYP图 3 GP 及 GYP 的动态吸附曲线2.2 栀子黄色素及栀子苷的动态解吸表 4 动态解吸数据记录及处理时间 /min 10 15 20 25 30 35 40 45稀释倍数 50 500 500 5000 5000 2000 2000 1000A238 0.640 0.270 1.062 0.260 0.240 0.378 0.275 0.33GPGP mg/ml 1.03 4.38 17.23 42.18 38.94 24.53 17.84 10.71稀释倍数 50 500 500 500
18、0 5000 2000 2000 1000A440 0.079 0.854 0.748 0.160 0.143 0.257 0.181 0.277GYPGYP mg/ml 0.07 7.66 6.72 14.35 13.04 9.22 6.48 4.96时间 /min 50 55 70 85 100 130 160 190稀释倍数 1000 1000 400 400 100 100 100 50A238 0.242 0.176 0.200 0.135 0.266 0.163 0.128 0.240GPGP mg/ml 7.85 5.71 2.60 1.75 0.86 0.53 0.42 0.3
19、9稀释倍数 1000 1000 400 400 100 100 100 50A440 0.200 0.149 0.211 0.157 0.416 0.286 0.225 0.351GYPGYP mg/ml 3.60 2.69 1.50 1.15 0.74 0.50 0.41 0.310.010.020.030.040.050.00 50 100 150 200时 间 /minmg/ml GP GYP6图 4 GP 及 GYP 的动态解吸曲线GP 动态吸附量=(C 原液 V 原液 -C 漏出 V 漏出 -C 水洗 V 水洗 )/V 树脂=(56.9570.0-17.1380.0-8.2548.5
20、)/15=147.73 mg/mL 树脂GYP 动态吸附量=(C 原液 V 原液 -C 漏出 V 漏出 -C 水洗 V 水洗 )/V 树脂=(4.1370.0-0.4180.0-0.5048.5)/15=15.47 mg/mL 树脂GP 动态解吸率=(C 解吸液 V 解吸液 )/V 树脂 /树脂吸附量100%=(0.160120)/15/147.73100%=28.26%GYP 动态解吸率=(C 解吸液 V 解吸液 )/V 树脂 /树脂吸附量100%=(1.28120)/15/15.47100%=66.42%3 栀子黄色素的吸收光谱及色素成分的测定表 5 吸收光谱数据记录/nm 200 238
21、 280 320 360 440 500 550 600OD值 0.924 0.835 0.248 0.339 0.160 0.255 0.060 0.017 0.0110.00.20.40.60.81.0200.0 300.0 400.0 500.0 600.0 /nmOD值图 5 栀子黄色素溶液的吸收光谱图A238/A440=0.835/0.255=3.274 栀子黄色素理化性质和稳定性测定取 1栀子黄溶液，按各步骤要求取定量体积，测定在酸、碱、热、氧化剂条件下的栀子黄稳定性的影响。4.1 pH值对色素稳定性的影响表 6 溶液 pH 值对栀子黄色素水溶液稳定性的影响pH 1 3 5 7 9
22、 11稀释倍数 100 100 100 100 100 100A238 0.704 0.671 0.660 0.670 0.631 0.606GP mg/ml 2.28 2.18 2.14 2.17 2.05 1.977A440 0.205 0.207 0.209 0.210 0.217 0.212GYP mg/ml 0.37 0.37 0.38 0.38 0.39 0.380.00.51.01.52.02.50.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0pHGP mg/ml0.00.10.20.30.40.5GYP mg/mlGP GYP图 6 溶液 pH 值对栀子黄色
23、素水溶液稳定性的影响4.2 温度对色素稳定性的影响表 7 温度对栀子黄色素水溶液稳定性的影响温度（） 4 25 40 60 80 100稀释倍数 100 100 100 100 100 100A238 0.661 0.660 0.656 0.744 0.710 0.72GP mg/ml 2.14 2.14 2.14 2.40 2.30 2.33A440 0.209 0.208 0.206 0.159 0.129 0.139GYP mg/ml 0.37 0.37 0.37 0.29 0.23 0.250.00.51.01.52.02.50.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0温
24、 度 /GP mg/ml0.00.10.20.30.40.5GYP mg/mlGP GYP图7 温度对栀子黄色素水溶液稳定性的影响5.4.5 氧化剂和还原剂对色素稳定性的影响 表 8 氧化剂对色素稳定性的影响过氧化氢（%） 0 1 3 5 10稀释倍数 100 100 100 100 100A238 0.441 0.550 0.780 0.971 1.152GP mg/ml 1.42 1.80 2.53 3.15 3.74 8A440 0.140 0.131 0.131 0.127 0.123GYP mg/ml 0.26 0.24 0.24 0.23 0.22 0.00.51.01.52.02
25、.53.03.54.00.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0H2O2/%GP mg/ml0.00.10.20.30.40.5GYP mg/mlGP GYP图 8 氧化剂对色素稳定性的影响六、实验结果与讨论1 CO2超临界脱油或有机溶剂脱油结果与讨论超临界流体萃取技术萃取生物活性物质，一般只对分子量较小和极性不大的挥发油，小分子萜类及生物碱有效，选择超临界流体萃取技术萃取栀子油，能连续进行，萃取过程密闭且排除了遇空气氧化和见光反应的可能性，使萃取物稳定；在提取过程中，它们的天然活性成分和热不稳定成分不易被破坏。从而最大限度地保留了栀子油的生物活性。2 栀子黄色素的乙醇提取或自来水提取结
26、果与讨论（1）乙醇提取法由于栀子黄易溶于乙醇，所以浸取剂选用乙醇。该方法得到栀子黄色素粗提液纯度较高，杂质含量少，有利于进一步的分离纯化。（2）水浸提法栀子黄色素含有亲水基团，易溶于水，可采取水浸泡的办法提取色素。水提法通过粉碎、脱脂、浸提、过滤、浓缩，提取20%50% 的浆料。该方法具有工艺简单、生产成本较低等优点，但该法生产色素纯度低，外观质量差，产品为20%50% 浆料，难以精制，使用价值不大。3 栀子黄色素的大孔吸附树脂静态或动态富集纯化结果与讨论从表9可以看出：动态吸附的效果明显比静态吸附要好，吸附量更大，但是栀子苷以静态解吸率大，而栀子黄以动态解吸率大。另外，从图2和图4可以看出，
27、GP和GYP无论静态还是动态洗脱出峰时间相近，无法达到分离纯化效果，所以洗脱工艺还有待进一步考察，或者选择其他分离纯化方法。表 9 栀子黄色素的大孔吸附树脂静态或动态富集工艺比较静态 动态吸附量mg/mL 树脂解吸率/%吸附量mg/mL 树脂解吸率/%9GP 21.93 78.00 147.73 28.26GYP 8.30 44.50 15.47 66.42 4 栀子黄色素理化性质和稳定性结果与讨论 栀子黄色素的吸收光谱根据图5，结果表明，样液中的成分在240 nm、320 nm、440 nm出现峰值，其中240 nm左右是栀子苷的测定波长，而320 nm是绿原酸的测定波长，440 nm是栀子
28、黄的测定波长，在这三个波长下测定相应的物质干扰较小。 pH值对色素稳定性的影响根据图6，结果表明，pH对栀子黄的稳定性影响很小；另外，随着pH 值的增加，栀子苷的含量略有下降，pH对栀子苷的影响比栀子黄显著。 温度对色素稳定性的影响根据图7，结果表明：050的条件下，栀子苷和栀子黄含量几乎不受影响。温度继续升高后，栀子黄开始不稳定，含量下降；而栀子苷的含量却反而上升了，在50时稳定性最好。 氧化剂对色素稳定性的影响根据图8，结果表明：随着氧化剂H 2O2 含量的增加，氧化剂对栀子黄稳定性的影响很小，但是随着氧化剂浓度的升高，栀子苷稳定性呈明显上升的趋势。七、思考题1. 为什么可以采用自来水提取
29、栀子黄色素？答：栀子黄色素中的主要成分是藏花素和藏花酸，含有亲水基团，栀子黄易溶于水，所以可采取水浸泡的办法来提取色素。2. 要提高栀子黄色素的色价或纯度，该采取哪些有效的方法？请提出一个合理的改进措施。答：栀子黄色素的有效成分是藏花酸和藏花素，其中藏花酸是酸性成分，易与碱发生反应生成离子，所以碱液浸取可以提高浸取率。但是由于生成的离子不能吸附于大孔吸附树脂上，用碱液作浸取剂又会造成栀子黄有效成分的流失。水浸取液中含有大量的果胶，难以进行分离。所以用50 % 乙醇水溶液作浸取剂较为合适。根据树脂吸附特性，水中乙醇的存在对吸附不利，所以采用旋转蒸发器蒸发掉浸取液中乙醇，得到浓缩液作为精制栀子黄的
30、母液。此外，目前研究提高栀子黄色素的色价方法较多，有合成树脂层析分离、膜分离法等。3. 栀子黄色素为什么要避光保存？答：由于分子中存在多个共轭双键，栀子黄色素对光有一定的不稳定性。但暗处理对色素的影响较小，所以栀子黄色素要避光保存。4. 栀子黄色素在保藏或使用过程发生褪色或绿变，该如何解决？答：藏花酸、藏花素分子本身含有多个不饱和共轭双键，易受亲电试剂破坏，逐渐变为饱和烃，色素吸收峰向紫外区飘逸，即发生褐变，可以通过添加色素稳定剂，它能稳定栀子黄色素的分子结构，螯合色素中的金属离子，增强色素的稳定性。也可以添加多聚磷酸钠等护色剂，防止褐变。把栀子黄色素中栀子苷的含量降低到肉眼所不能见到，即可以
31、有效地防止绿变的发生。105. 根据栀子黄色素的理化性质和稳定性结果，你该如何合理使用栀子黄色素？请提出一个合理的建议。答：在分离纯化栀子黄色素中应使其A 238/A4400.4,则可避免绿色的发生，同时栀子黄色素的稳定性较好，但耐光性和抗氧化性较差，故最好密闭避光保存、防止与氧化剂、还原剂、金属离子接触。6. 栀子油的 CO2 超临界脱除和有机溶剂脱除工艺的异同点如何？答：相同点：都是对混合物中的某些成分进行选择性的提取。不同点：1)选择超临界流体萃取技术萃取栀子油，萃取过程密闭、连续进行，排除了遇空气氧化和见光反应的可能性，使萃取物稳定;在提取过程中，它们的天然活性成分和热不稳定成分不易被
32、破坏。从而最大限度地保留了栀子油的生物活性。2）作为一种新型溶剂，超临界二氧化碳它具有不同于传统的液体溶剂的性能。超临界二氧化碳的密度接近于液体，使它具有很好的溶解性能；另一方面它又有与气体相近的高渗透能力和低致度( 扩散系数) ，表面张力接近于零，因此它具有良好的传递性能，可以很快的进出被萃取物的微小结构中，这是一般溶剂所没有的。7 栀子黄色素的乙醇提取和水提取工艺的异同点如何？答：水浸取法浸取的栀子黄色素杂质多，浓缩时粘度大、难过滤、纯度低、色泽差。水-乙醇浸取温度提高有利于浸取率的提高，但受水-乙醇体系共沸点限制，栀子黄色素热不稳定，因此，温度过高反而降低浸取率和纯度，一般 5060为宜。
