细胞DNA定量分析技术手册.pdf

1、 麦克奥迪（厦门）医疗诊断系统有限公司 - 培训教材 细胞 DNA定量分析 技术 指导 手册 二 一 二 年 二 月 目录 一 半定量液基细胞学制片操作指南 - 1 - 二 . DNA 染色程序（ Feulgen 染色） - 7 - 三 . MotiCytometer 1.1操作手册 - 9 - 四 . Classify软件介绍及操作说明 - 21 - 五 . 质控标准片数据分析 - 35 - 六 . DNA报告解读及实例分析 - 38 - 七 . HIS资料管理系统使用说明 - 65 - 八 . 实验室仪器维护保养 - 78 - 附录 1：细胞 DNA倍体定量检测标本满意及发放报告条件 -

2、82 - 附录 2： MotiCytometer简要使用流程 - 83 - 附录 3：数据分析注意事项及常用诊断语言建议 - 84 - 附录 4： HIS资料管理系统简要操作流程 - 85 - 附录 5：实验室应急处理方案 - 86 - 附录 6：巴氏染色程序及 染色过程中注意事项 - 88 - 附录 7：有关标本和试剂存放的规定及注意事项 - 91 - 附录 8：半定量制片细胞沉淀及稀释体积对照图 - 93 - - 1 - 半定量液基细胞学制片操作指南 1 处理载玻片 制片前，将载玻片预先放置于玻片架上，随后放入配制好的粘片剂中，浸泡至少 10分钟。将浸泡好的玻片拿出，在滤纸上吸干，晾干后备

3、用（载玻片应至少提前 2-3小时处理完毕）。 粘片剂稀释方法： 220ml 蒸馏水中加入 2ml粘片剂，可处理 400-800张载玻片。稀释后的粘片剂室温下使用不超过 1周。 2 标本确认并编号 取待检标本管和申请单，分 别用记号笔在标本管和申请单上标上流水号，在试管架中准备好与标本管相对应的 1支离心管（ 10ml左右）和 2支圆底试管（ 5ml左右，一支用于 DNA制片，另一支用于 TBS 制片），离心管用记号笔标上编号，此编号与标本管编号应一致，圆底试管上可分别标上“ D”（用于 DNA制片）和“ T”（用于 TBS制片）。 3 排列玻片 制片前，用试管架的底面将编好号的玻片依次沿水平滴

4、片板上的白色平行线排列整齐，平行线中下方的一条用于对齐玻片的底边缘，上方的一条用于指示滴- 2 - 片的位置（如果暂时没有滴片板，则在干净水平的桌面上用铅笔画两条 相距 3cm的平行线代替）。 4 添加细胞分散剂 分别向每个圆底试管中加入 100 l的细胞分散剂。 5 转移标本、离心 将标本瓶放在点触式混匀器上振荡 3-5秒，缓缓向尖底离心管中倒入 6ml左右的标本溶液。离心管经平衡后放入离心机，离心速度设置为 1500转 /分钟，时间设置为 5分钟，开始离心。 6 倒上清 离心完成后，逐个将离心管中的上清液倒出，并在滤纸上尽量吸尽管内的残余液体，此时可观察到离心管底部有沉淀的细胞团块。注：如

5、果发现细胞沉淀过- 3 - 少且较为松散，则最好用滴管 从上部将管中的上清液吸出，防止细胞被倒出而造成损失。 7 稀释细胞沉淀 针对每个标本，观察其离心管中细胞沉淀的大小，并将其与示意图（见附件）上的模拟标本体积逐个进行对比，确定所需的稀释体积，原则上稀释体积为细胞沉淀体积的 2.5-3倍。 根据确定的稀释体积，用可调式移液器向相应的尖底离心管中加入定量的蒸馏水，如果没有可调式移液器，也可以直接用定量移液器或吸管向离心管中逐滴加水至示意图中黑线标识的位置。 - 4 - 8 转移细胞悬液 所有离心管中的标本经稀释后，先将第一个标本的 离心管放在点触式混匀器上振荡 3-5秒，用吸管吸取适量细胞悬液

6、，向用于 DNA制片的圆底试管中加入 2滴细胞悬液，向用于 TBS制片的圆底试管中加入 1滴细胞悬液。然后用同样的方法转移下一个标本的细胞悬液，直至所有标本都转移完成。 9 滴片 针对每个标本，同时将 2个圆底试管（ DNA和 TBS各一个）于混匀器上再次振荡混匀 3-5秒，用吸管从用于 DNA制片的试管中吸取适量的细胞悬液，于相应载玻片正上方约 3-5cm处，垂直滴 2滴左右的细胞悬液至载玻片中心，完成 DNA制片，然后吹出吸管内的残余液体，从用于 TBS制片的试管中吸取适量的细胞悬液，按同样的方式进行 TBS制片。 10 晾干 同一组标本滴片全部完成后，将所有玻片缓缓平移至水平底板前端，进

7、行下一组操作。玻片自然晾干后即可进行染色。 - 5 - 补充方案 对于那些细胞数偏少的部分标本，如果第一次正常离心后发现细胞沉淀体积小于 20 l，则对上述方案做如下改动： 1 添加细胞分散剂 向该标本相对应的圆底试管中加入 50 l左右的细胞分散剂。 2 转移标本、离心 将标本管进行振荡，将其中的所有标本倒入相对 应的离心管；并再次加入少量蒸馏水进行振荡，收集采样器上和管内残留的部分细胞。离心管经平衡后离心 5分钟，离心速度设置为 1500转 /分钟。 - 6 - 3 去上清 倾去上清液，并倒置于滤纸上尽量吸尽残留液体。 4 稀释细胞沉淀 通过目测的方式，向每管的细胞沉淀中分别加入大约 2.

8、5-3倍体积的蒸馏水。 5 转移细胞悬液、滴片 用吸管吹散细胞，并在振荡器上混匀；用吸管吸取 1滴细胞悬液转移至用于DNA制片的圆底试管中，再次吸取半滴左右的细胞悬液转移至另一支用于 TBS制片的圆底试管中，再次振荡混匀。按与上述方案中同样的方式分别进行 DNA和 TBS制片。 - 7 - DNA 染色程序（ Feulgen 染色） 1. 材料 1.1 所需化学试剂 染料 A 甲 醛 染料 B 冰醋酸 无水乙醇 蒸馏水 浓盐酸 二甲苯 中性树胶 甲醇 1.2 溶液配制 1.2.1 5N 盐酸 ：蒸馏水与浓盐酸按 58% : 42%比例混合即可。 例：配制 100ml 5N 盐酸 先量取 58

9、ml蒸馏水倒入 试剂瓶中 ，再缓缓加入 42 ml 浓盐酸，混匀备用。 (注意是浓盐酸加入蒸馏水 ) 1.2.2 Bohm-Sprenger 固定液 ：甲醇、甲醛、冰乙酸按 80% : 15% : 5%比例混合即可。 例：配制 100ml B.S固定液 a. 分别量取 80ml 甲醇、 15ml 甲醛及 5ml 冰醋酸，倒入试剂瓶中； b. 搅拌混匀，于试剂瓶中封存备用。 1.2.3 DNA染液 （ 100ml, 在通风橱或过滤橱中配制因产生 SO2） a. 取容积大小合适的搅拌瓶一个， 用锡箔纸包裹 （或用棕色瓶） ； b. 将瓶倾斜后，轻轻放入搅拌籽； c. 加入 0.1克染料 A和 0.

10、1克染料 B； d. 量取 98ml 蒸馏水于搅拌瓶中 ，（注意涮洗染料 A的小瓶和搅拌瓶 的瓶 壁）； e. 用移液管加入 2ml 5N盐酸； f. 生化培养箱中避光 搅拌染液混合物 1-1.5小时（ 252 ）； g. 过滤染液，温度不得低于搅拌温度（染液应当呈蓝紫色，过滤后没有可见 沉淀物即为可用。为了达到最佳染色效果，染液不重复使用，现配现用。） - 8 - 2. 染色方法 2.1 将切片置 B.S固定液中固定 50min； 2.2 流水洗涤 4 5次； 2.3 5N 盐酸酸解 1小时 (252) ； 2.4 流水洗涤 4 5次； 2.5 将切片置染液中染色 75min（ 252 ）；

11、 2.6 流水洗涤 4 5次后， 水中继续浸洗 15min； 2.7 脱水：置 50 75 100 100 100酒精中逐级脱水，各1min； 2.8 湿式封片：切片迅速依次转入无水乙醇 : 二甲苯（ 1:1） 100%二甲苯 100%二甲苯，各 1-3分钟；最后一张一张取出，滴加中性树胶封片。 3. 结果 细胞核：深蓝 - 紫色 4. 注意事项： 4.1 试剂应密闭储存于避光、干燥处，温度控制在 25-30； 4.2 为了达到最佳染色效果， DNA 染液不重复使用，现配现用； B.S 固定液及5N盐酸需提前配制 ； 4.3 配制 DNA染液 时应避光进行，搅拌、过滤、染色要尽量在同一温度下进

12、行，否则搅拌时已经溶解的染色剂会由于温度降低而被析出，造成结晶，影响染色与扫描结果； 4.4 在配制染液时，磁力搅拌子形成的漩涡高度在 2cm 左右会较好，且漩涡应 均匀，不要有气泡产生，否则会将空气引入染液； 4.5 从脱水到封片过程中要迅速，防止 切片在湿空气中吸取水分，出现云雾状 ； 4.6 封片应当 湿封 ，二甲苯浸片后勿干即滴加树胶封片， 防止产生细胞收缩， 龟裂或切片出现黑色结晶样小点 ； 4.7 制片要求外观干净，条码要贴正，边缘不得超出载玻片。无树胶堆积或 溢 出。 4.8 盖玻片要贴正，无气泡及因细胞干燥引起的收缩所形成的胞质内褐色皱 折。 - 9 - MotiCytomet

13、er 1.1操作手册 MotiCytometer 1.1 是当前使用的扫描软件，它 有两个主要界面： “ 操作布局 ” 界面和 “ 设置布局 ” 界面 ，两个界面可以通过软件左上方的选项卡进行切换 。如为首次使用， 需要在设置布局 界面里 预先 设置各项扫描参数。 1. 设置布局 “ 设置布局 ” 页 中 主要 有 3项常规操作： 设置扫描参数 采集合适的背景 校准 图像 设置 扫描范围 1.1 设置扫描参数 主要扫描参数包括： 所 用 Classifier、扫描 模式 、 扫描时间限制 、 细胞数限制 、输出路径 等，这些 均 由 麦克奥迪 质控部按照标准制定。 未经麦克奥迪允许，请勿擅自修

14、改主要扫描参数 。 设置扫描参数 设置背景校准图像 设置扫描范围 - 10 - 1.1.1 “ 项目列表 ” 下拉选项中有三个项目： Cspin2、 Smear2 和 Liver。 其中 Cspin2和 Smear2都是用 于 扫描宫颈片， 两者唯一不同之处在于 Smear2的扫描范围更大，这样系统可以保存两个不同的 扫描范围 ，通常我们 使用 Cspin2。 Liver 用于扫描标准片来检查系统性能，因要检查片子中 DNA测 量的线性情况，所以 Liver 中的 Classifier 会接受 标本中重叠的细胞核。每个项目中都包含所用的Classifier、 输出路径、扫描时间限制、扫描数限制

15、和扫描范围等。如果要更改并保存 扫描 参数， 勿使 用项目列表下的 “ 另存为 ” 和 “ 删除 ” ，只 需 点击 “ 开始扫描 ” ， 更改后的设置就会 自动 保存。 在以后使用时， 只要 从 项目列表中选择所需的项目，各参数就 会自动 选择上次使用时的 设置 作为默认设置 。 1.1.2 “ 扫描模式 ” 主要分两种：从中心开始的螺旋式扫描和从 X 轴或 Y 轴开始的优先式扫描。螺旋式又分为顺时针螺旋和逆时针螺旋。考虑 到 临床片的标本大多呈圆形分布的 原因，一般都选择螺旋式扫描。 X 或 Y优先多应用于质控 片的扫描。 1.1.3 “ 网格间隔 ” 是指扫描时是否需要跳过切片的一些视野

16、，如果是面积很大的涂片可以选择这一项。通常这项设为 “ 无间隔 ” 。 1.1.4 “ 圆形区域 ” 是指切片是否为圆形制片，如果是，选中此栏，这样系统就不会浪费时间扫描圆形以外无细胞的区域。 1.1.5 除非扫描时达到细胞数限制或整张切片都扫完，要不然只有达到 “ 扫描时间限制（分钟） ” 中设置的时间，扫描才会停止。平常制片良好的片子一般不用扫这么长时间就会完成扫描。 1.1.6 “ 细胞数限制 ” 是指追踪列表中各目标细胞组细胞总数的最大值。质控部有时候会调整这个值。本材料发放时，此值设为 8000，以后可能会 改 大一些，因其对阴性标本有很大影响。 1.1.7 “ 网格 ” 是指扫描范

17、围 需要分多少个视野来扫描 。 一般扫描范围越大，网格数值越大。 1.1.8 “ 输出路径 ” 是指扫描完成时产生的数据文件存放的位置， 可点击 更改 ，一般不存放在 C盘 。 1.2 采集合适的背景校准图像 背景校准图像 有两种 ：明视野和暗视野。 - 11 - 为正确检测细胞核中的 DNA 含量，需要采集视野空白处的 背景 校准图像。 由于 切片对科勒照 明有很大影响 ，背景校准 图像须 在 有盖玻片的位置 处 采集。背景校准图像还 能 部分矫正 由于 非均匀照明（通常视野中心最亮）、摄像头反应固定模式的变化及摄像头或光路中灰尘而引起的偏差。 （ 系统的光路部件 应 保持洁净。 ） 只要显

18、微镜光路有调整，就应 重新 采集 明 视野校准图像 （ 如调整聚光镜 NA或视场光阑后 ） 。即使显微镜光路部件未调整，也应定期 重新采集 明视野校准图像，至少一周一次，最好是一天一次。 须将 显微镜设置 为 科勒照明， 才能采集合适的 明视野校准图像。 1.2.1 设置科勒照明 以下为指导科勒照明设置的几个英文网站： http:/ http:/ http:/micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/transkohler.html 确认 “ 设置布局页 ” 中的 “ 适合窗口 ” 处于选中状态。 当 “ 适合窗口 ” 没有选中时，摄像头图像按原比例大小显示在窗口

19、中，不能完全显示整个视野的图像，可通过水平和垂直滚动条移动并查看图像。一般都会选上 “ 适合窗口 ” 。 使用标准 20 NA=0.40 黑色平场物 镜时，聚光 镜 NA 设为 0.35； 使用 20NA=0.45 白色物镜时， 聚光镜 NA设为 0.4；使用标准 20 NA=0.50银色荧光物 镜时，聚光镜 NA 设为 0.4；使用 20NA=0.60 镜头时，聚光镜 NA设为0.5。 在载物台上放置切片并聚焦。 把视场光阑关到最小。 调节聚光 镜高度，使视场光阑聚焦。 调整聚光镜调节柄，使视场光阑位于视频图像窗口中间。 检查切片是否仍然聚焦良好，如果没有聚焦，重复以上步骤。 推入显微镜拉杆

20、， 通过目镜观察， 并 打开视场光阑 ， 调节 视场光阑的大小至与目镜视野的圆形内接或外切位置，此时 应可以看到整个视场光阑，允许其不在目镜视场中心 ， 如右图所示。 调整照明，使灰度值为 220-230，接近 230更好。 - 12 - 1.2.2 采集 明视野校准图像 右图是 当前 图像的灰度值直方图， 图形下方 有 直方图统计数据 ， 没有扫描时，会动态更新 。 “ 最小值 ” 是指最小 /最暗灰度值。 “ 最大值 ” 是指最大 /最亮灰度值。 “ 峰值 ” 是指灰度值的最高峰，应在 220-230之间。如果峰值没有处于两条黑色标尺线之间，即218-232，系统会拒绝扫描，图中的白色标尺

21、线为峰值位置。 “ 标准差 ” 和 “ 相关系数 ” 只有在视野为空白时才有意义，见 本章节 “ 采集合适的背景校准图像 ” 。 “ 亮度阈值 ” 为亮像素阈值，即超过该值即在图像中显示为红色， 如 直方图中红色标尺线所示 。 “ 采集合适的背景校准图像 ” 的步骤如下： 1. 首先放上一张玻片，移动显微镜载物台，找到细胞并聚焦清晰。 2. 细胞聚焦 清晰 后， 将 切 片移到 有盖玻片处的一 空白位置， 不要选中 “ 应用背景校准 ” 项 。如下图所示，调整 “ 亮度阈值 ” 至 230左右以增加亮像素和暗像素之间的对比，检查图像（比亮度阈值更亮的像素都显示为红色）。 图像中大大小小的白点可

22、能 由于 切片 、 摄像头或光路不 洁净 造成。可移动一下载物台，随其一起移动的白点 表明不洁净处来自于 切片，如果不移动即 可能来屏幕 右上方是载物台和调焦的控制键， 左边 XY为水平移动载物台，右边 Z 为聚集。 调焦键中左边为粗调 ，右边为微调 ， 按钮 为自动 聚焦 。 如果点击载物台移动键，载物台一次性移动太多的话，可选择 设置 显微镜设置 ，然后在弹出窗口中更改移动速度。调节滑条可设置手动调焦和载物台移动的速度，且不改变扫描速度 。 - 13 - 自于 摄像头或光路中；转动摄像头， 移动 的 白点表明不洁净位置在 光路，不动的即来自于摄像头。 若有此情形，请 按照 标准步骤清洁摄像

23、头、 镜头或聚光镜 。 若想在 切片上 找 完全干净的 视野不太可能， 但应 尽量找一个 在 移动切片时，相对来说只有少数白点会 随之 一起移动的视野。当调整背景校准图像时，实际上程序会收集 4 张图像，每张 X 轴、 Y 轴会有些不同，然后平均这几张图像， 从而减少白点的影响。如果是用这种方式，图像 中 的白点一定会比实际的白点小。通常来说，一些区域的背景会和其他视野的背景不一样，如下图左中虚线圈内所示，下图右是增加对比度后的图像。图中这样的区域面积太大，会影响有效平均数的计算，这样的明视野校准图像不合格。 3. 能看到清晰图像时，点击 “ 保存 校准 图像 ” ，出现校准图像进度条 表示系

24、统 正在 记录并平均 4张背景图像。 可能来自切片 可能来自摄像 头 - 14 - 4. 背景校准图像保存好后，选 中 “ 应用背景校准 ” ，检查直方图和图像。 若 背景校准图像选择得好，可弥补摄像头固定模式反应中不均一照明偏差 及 部件中灰尘的影响，直方图的 CV 值一般 会 小于 2。检查峰值是否为 220-230之间，接近 230更好。此时图像中的红色像素应该比上图中看到的分布更均匀。在校准图像保存和应用前，可能一些点的 4个影像会很明显，他们会平铺排列。当稍微移动 X 轴或 Y轴时，图像会有变化，但是红色像素还是应均匀分布，直方图的 CV可能会有一些浮动，但应还是在 2以下。 1.2

25、.3 采集暗视野校准图像 和明视野校准图像一样，要正确计算 DNA 含量，也需调整暗视野校准图像。但是，暗视野校准图像主要和摄像头曝光时间和温度有关，所以没必要经常调整暗视野校准图像，一个月调整一次就可以。 具体操作步骤如下： 1. 将 目镜旁的滑杆推入，挡住进入摄像头的光 ，去掉“应用背景校准”前的钩，采集 暗视野校准图像。此时直方图灰度值 参数 应如下图箭头所示，一般最小值为1， 峰值为 3。 如果不是，请联系 技术人员 调 整 “ 视频设置面板 ” 中的偏移量 。 2. 如果参数正确，点击“保存黑图像”，稍后会出现“黑 图像校准成功”提示窗口，点“确定”，勾上“应用背景校准”前的钩，完成

26、暗视野校准图像的采集。 - 15 - “ 视频 ” 中显示了由技术部设定的曝光时间、偏移量，这两项不能自行更改。 开始扫描前，应选中 “ 应用背景校准 ” ， 软件首次使用时，本项为灰色 。当 “ 适合窗口 ” 选中时，摄像头图像会被压缩， 在“观察 窗口 ”中可看到 当下 完整的摄像头视野图像； 1.3 设置扫描范围 “ 设置布局 ” 页 底 部 中 间 为设置扫描范围的扫描地图， 技术部最初设置的扫描范围可能和实际切片上细胞分布的范围不太相符，可通过扫描进度窗口中的扫描地图 来查看。地图扫描 时 ，有细胞的视野 显示 为黑 点 ，没有细胞的视野为 灰白色 ，未扫的视野为 深墨绿色 。 选择

27、染色 较 深的 切 片，在 “ 设置布局 ” 页，选择 “ 地图扫描 ” 。 MotiCytometer 1.1 系统会快速地扫描 “ 设置布局 ” 页底下的绿色矩形区域，如 右 图所示。当快速扫描完成后，可以看到切片上细胞的大概分布区域 （ 如下图所示 ） 。如果扫描范围 与 细胞分布区域不太相符，重置调整绿色扫描范围。 每张切片上细胞的分布不完全一样 ，一般会让扫描范围比细胞分布区域稍大一 些 ，并尽量使其居中。 注意，只要拖动绿色区域上任 何一角的小正方形，可把扫描范围调整成正方形（如果是矩形，应调整成正方形）。之所以这样设，是因为我们大部分片子上的细胞分布都是呈圆形的。绿色圆圈可以作为

28、大概参照。拖动绿线上的小菱形，就可调整成矩形。如果把鼠标放在绿线上，指针变成十字 箭头 形，就可以拖动整个绿色区域而不改变其大小。如果点击扫描地图内的任何区域，载物台就会马上移至所点位置，并有白色垂直和水平虚线显示该位置。 如果点击 “ 开始扫描 ” ，当 前 的扫描范围就会被保存在该项目下。 - 16 - 标准片的扫描范围可 根据标本的实际范围设定 。在扫完 宫颈切 片后，把十字交叉线放在扫描地 图中心并点击，载物台移至此处 ，改用 Liver 项目，以十字交叉线为中心，设置 扫描区域。 2. 操作布局 MotiCytometer 1.1 软件打开时，会直接显示为操作布局， 如下 图所示 。

29、 在此布局中，可以进行一般性操作并显示扫描标本的信息，但 各项参数不能调整。 2.1 双击鼠标左键运行软件， 显微镜的载物台会先复位，并弹出 等待 上片和 读取条形码 的对话框。 放置一张玻片在载物台上 ，先 检查 扫描 参数 的 设置是否符合当前所要扫描切片的要求 ， 如有不符，点击 “ 等待读取条形码 ” 窗口中的 “ 取消 ” ，并转到 “ 设 置布局 ” 页做 所需 调整。一般来说，大部分切片的扫描参数都大致相同，无需每次扫描时都做调整 ，但 如果是当日扫描的第一张标本，需要检查科勒照明并在设置布局里保存新的明视野校准图像。 （详见 本章节 “ 采集合适的背景校准图像 ” ） 2.2

30、如果此前已经在设置布局里进行过扫描参数设置、校准图像采集、扫描范围设置等，则可以点击“触发”选项，读取条形码。如果切片上没有贴条形码，或者条码 读取器 无法正确读取，可以在对话框内手动输入条形码 并点“确定” 。 如果 系统检测到 该条形码 曾经读取过 ， 则 会 提示已重复扫描的次数，并询 问是否要重新扫描 。 2.2.1 在开始扫描前，需要首先聚焦到切片上的细胞。可 通过 下 图中 的 粗调、 微- 17 - 调或自动 聚焦 按钮 来 聚焦 （一般只需对 第一张 切片聚焦 ） 。 大多数片子的扫描起点 位于 细胞分布区域的中心， 在 “ 观察窗口 ” 中应能看到细胞 （ 如下图所示 ） 2

31、.2.2 检查上图蓝色 处的照明是否在所要求范围（ 可 参 看 直方图中 黑色标尺线 及 下 方 数值 ， 分别 为218-232）。如果直方图峰值在范围内 （ 如 右 图中箭头所示 ） ， 则可开始扫描 。如果峰值不在所示范围，系统会拒绝 开始扫描。出现此类情形的常见原因是细胞没有聚焦，应调焦看是 否解决。还 有可能是视野范围内的细胞太密，需调节载物台 XY控制轴，移至细胞密度稍低的区域，并调焦。如果这样还是不能把照明调至所要求范围，就需调节显微镜的光路亮度。不过这种情况应很少，如果频繁出现，就应该是光源、摄像头或其他部件有问题。 2.2.3 点击操作布局中的 “ 开始扫描 ” ，系统开始扫

32、描。 2.2.3.1 进度窗口： 开始扫描后会弹出 如下 图所示 的 进度 窗口 ， 显示 内容 包括 ：条码、已扫描时间、细胞总数、 IOD、扫描地图、各细胞分组及计数。扫描地图 方格 的颜色分别代表： 红色 为 当前扫描 视野 ，黑色 为 已 完成 扫描 视野 ，空格 为 未 扫描 视野 。 - 18 - 2.2.3.2 观察窗口：正常扫描过程中，观察窗口中的图像 会 不断变化。偶尔会出现如下图左所示情形，这是光太亮造成的（红色代表 =255 的饱和灰度值的像素，黄色代表灰度值 247 的像素），出现一些这样的像素点是不奇怪的，尤其是 在 图像 尚未 聚焦时。但是，如果 此类像素较多 ，特

33、别是 位于 视野中心时 （ 如下图右 ） ，表示照明太亮，应终止扫描并调整照明。如果经常发生这种情况，且显微镜的科勒照明设置良好的话（见 本章节 “ 采集合适的背景 校准 图像 ” ），可能是光源不稳定造成的，应联系 麦克奥迪 。 在细胞密度高的视野，图像很暗的区域可能 出现 有深蓝色或绿色像素点 （ 蓝色代表 8 的灰度值的像素，绿色代表 = 0 的灰度值的像素 ） ，细胞密度高出现这种情形的可能性就大。如果细胞密度不高时这种蓝色像素点仍然多，有可能是照明不够引起。 2.2.4 正常终止扫描：当一张片子扫描完后，系统会有声音提示，并移至上片处等待放置新的切片。 正常终止的 三 种情况：扫描达

34、到时间上限（目前为 60 分钟）；扫描达到细胞数上限（目前为 8000）；扫描范围完成。 其中以达到细胞数上限最为常见。 - 19 - 有时需要中途 停 止正在进行 的扫描，可以直接点击进度窗口上 的 关闭图标 ， 按照如下图弹出的对话框操作。 2.2.5 “ 操作布局 ” 页底部 右边 的窗口显示的是各张切片扫描情况，包括 切片序号、条形码、用时、细胞数、归一 IOD 及完成原因 等 信息 ， 以便对批次制片染色情况有大致的了解。 “ 设置 布局 ” 页中同样有这个显示。 1.3 质控标准片扫描 每天扫描临床标本片前须在每台设备上扫描质控标准片以检查其性能。 质控目的：主要是在 设备 上扫描

35、 “ 标准 ” 生物切片，以检查系统性能是否和前一天一样。如果性能稳定，连 续 几天的检查结果应差 别 不 大。 质控标准片扫描时，项目列表里应选择“ Liver”，扫描模式多采用 X/Y优先，将输出路径指定到独立的文件夹 ，扫描时间限制为 30 分钟，细胞数限制为 5000。 质控标准片扫描亦需要设置好科勒照明并保存好校准图像，如 Cspin2 模式已做相应设置，则不用再次设置。 质控标准片扫描后 主要定量检查以下 3项： 系统 DNA测量线性情况 二倍体峰 IOD 值 变异系数或二倍体峰宽度 - 20 - 除检查以上项目是否在参考值范围之内 ，更重要的是要比较同一张质控标准片扫描所得出来的

36、当天的值 与 前一天的值的差异 （ CV 值） 。如果差异大，即使 都在 参考 值范围内，也需调查原因并改进。 注意： 1. 每次和临床标本一起 染 标准片， 首先扫描 标准片 ， 扫描 完成后即刻分析，当 标准片分析正常时方可继续扫描临床片 。 2. 需要收集不少于 5000 个细胞， 使用可在 10分钟内扫描到 5000个细胞的质量良好的标准片。 （标准片 可向 麦克奥迪申购） 3. 须 使用 Liver项目，其 Classifier 会接受标准片中重叠的细胞核来检查片子中 DNA测量的线性情况。 4. 当标准片 CV值异常，且原因无法判断时，可采用近期染色的标准片做比较 。 5. 染色后

37、放置时间 久了或 者 暴露在光线下 ，标本片 都会褪色，所以不使用时 应 注意避 光保存 。 6. 因为相机反应和光源都与周围环境温度有关，因此，开机至少 30 分钟以确定设备系统状态稳定后再扫描标准片 ，或者 摄像头电源开关 可以 一直开着。 1.4 常见问题 如果多个病例中多次出现同一细胞核重复现象，如下图所示，应是载物台存在硬件问题，此情形请联系技术中心。 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150215216217218219220221222223224225226227Bo t h w a rm u pC a m e r

38、a w a rm u pC a m e ra I m a g i n g w a rm u pL i g h t w a rm u pB oth w a r m u p2/ D oF = 0. 00 33 3R2= 0. 99 90 2y = A ( 1 - e- k( x - xc) A 22 3. 29 76 5 0. 00 30 1xc- 68 . 82 03 9 0. 18 10 5k 0. 04 65 0. 00 01 1meangreylevelT i m e (m )C y t ome t e r W a rm U p Tim e1 8 A p r 0 9图像分析系统预热时间 摄

39、像头预热 获取图像预热 光源预热 摄像头和 获取图像 同时 预热 - 21 - Classify软件 介绍 及操作说明 对于 Classify程序 的 设置 没有固定的要求 ，操作者可根据自己的习惯方式设置。以下是常见的页面图例，包含了直方图、散点图、细胞组、参数选项、 细胞核 图库、细胞核放大图像 /轮 廓图。操作者可自行调节这些窗口的大小和位置，并设置相关参数。 1.功能面板 Classify软件中的最常使用的功能窗口为：直方图、散点图、细胞图谱、参数、组别等。 1.1 直方图 通过 图表 直方图 ， 打开直方图 。 打开直方图 - 22 - 直方图中 纵坐标默认为细胞数，横坐标显 示的是

40、 “ 参数 ” 中 所选项 目 ， 在病例分析时， 通常我们 选择 查看 的是 DNA_Index（ DNA指数 ） ， 它的 刻度 一般设为0-5，系统默认的是 4个 刻度 ，但读起来不方便 （如第一个刻度其 DNA指数为1.25） ，大多数操作者觉得设成 5个分格比较方便，可通过直方图窗口中的 刻度 值 设置，如 下 图 所示。其中 “X” 通常设为 5； “Y” 的设置在这无影响； “ 比例 ” 设为 100，可以使得计算更简单。 操作者应熟悉直方图中 “ 查看 ” 菜单的 4个命令： 标尺线 ， 全部 ， 组合 和 分组 ，如右图所示。请注意，直方图右上角显示的 统计 数据与所选细胞组

41、有关 (见 本章节 第 1页图示 )，也就是说，如果选择了 “ 全部 ” ，显示的 为 所有细胞组的数据；如果选择的是 “ 组合 ” 或者 “ 分组 ” ，出现的就是所选细胞组数据，并且这些数据的颜色与所选细胞组的颜色 是相对应的。同样， 2条标尺线显示时，右上方的选择横坐标参数 设置好坐标参数后一定要保存 设置直方图 刻度 设置横坐标最大、最小值 设置横坐标刻 度 - 23 - 数据 为这 两条线之间细胞的 统计数据 。直方图窗口左下角红紫色数字显示的是标尺线所在的位置。直方图中的 刻度 保存 命令可以保存所有设置，下次启用Classify程序的时候会自动 显示 该设置。 1.2 散点图 通

42、过 图表 散点图 ，打开散点图。 散点图同时显示 2个 参数 ，通过 查看 X 参数 或 Y 参数 菜单可以选择 并设置这 2个参数 ，大多数时候我们 设置 散点图的 Y轴 为 area(核面积 )， X轴 为DNA_Index（ DNA指数） ，其它 参数 比较少用到。 选择需设置的 X轴参数 点选 查看 X参数 设置 为 X轴 选择需设置的 Y轴参数 点选 查看 Y参数 设置 为 Y轴 打开散点图 - 24 - 和直方图一样，通常 X轴、 Y轴的分格都 可 通过 刻度 值 命令设为 5会较容易解读 ，如 下 图所示。这些设置也可以通过 刻度 保存 命令保存下来，下次启用Classify程序

43、的时候会自动 显示 该设置。通常打开 Classify程序的时候，DNA_Index显示 的范围不是 0-5， 而是该细胞标本的 DNA_Index最大和最小值，这可 以 通过 刻度 默认限制 来更改。（ 刻度 最大范围 或 刻度 默认限制 只显示其中之一 ， 二者可 通过 点击相互切换，散点图也随之同步更新 。） 如果散点图横坐标显示的是 参数的 最大范围 ，可点选 默认限制 进行切换 设置好坐标参数后一定要保存 设置散点图 X、 Y轴坐标参数 - 25 - 1.3 细胞 组别（ 细胞分类 ） 这里 各细胞组 以 不同的颜色 显 示， 即 程序中第 3组为 “ 正常二倍体细胞 ” ，通常 用

44、绿色表示其低风险度；第 5组为 “ 正常增生或疑似病变细胞 ” ，用橙色表明 应对其引起注意，可能存在风险；第 6组为 “ 病变细胞 ” ，用红色表示其真正存在风险。这 3种颜色 通过 下图左边所示的 “ 组别 ” 窗口中的 选项 颜色 命令来设置 ， 图示右边是选取的 3种颜色的 “RGB 设定值 ” 。 设置细胞组别颜色 RGB color content: 255,0,0 255,153,0 51,204,0 1.淋巴细胞 3.正常二倍体细胞 4.粒细胞 5.正常增生或疑似病变细胞 6.病变细胞 9.DI2.5的可疑垃圾细胞 - 26 - 操作者应该熟悉该窗口中 选项 隐藏 命令， 它

45、通常用来隐藏 no_name（无意义） 组（目前多为第 8 组） ，使直方图和散点图可以看得更清楚。但有时也不隐藏这一组细胞， 以便 查看 是否 有 有 诊断意义的细胞 误分 在这一组中。每组细胞都可以选择为 “ 隐藏 ” 或 “ 不隐藏 ” ，被隐藏的细胞组名称会显示为灰色。 1.4 特征参数 此窗口中有 100多个 参数 选项，但是 大部分 选项都不会经常 使用 ，直方图和散点图中的 参数 可通过这个窗口中 选项 选择 命令来选择，如下图左边所示 ，此时可 打开一个新窗口， 如 下图中间所示。按住 Ctrl键可进行多项 参数 选定，如要取消某已选定项，再点击一下该项即可。然后点击 OK按钮

46、，所选的项就会出现在参数 窗口中。下图右方显示的是常用的 参数 项： control_IOD （归一 IOD） , area（ 细胞 核面积） , stg_x（ 细胞 核在玻片 X轴坐标） , stg _y（ 细胞 核在玻片 Y轴坐标） , DNA_Index（ DNA指数） 和 DNA_Amount（ DNA含量） 。 选择需要隐藏的细胞类别，在前面的方格内打上勾，并点击OK 如要恢复隐藏的细胞组，可将组别前方格内的勾去掉，或点选 Clear全部清除 。 设置隐藏细胞组别 六个常用参数 按住键盘上的 ctrl键，鼠标点选所需参数 - 27 - 1.5 图像显示 通过 核图像 显示核图像 ，

47、打开细胞核图谱 。 每个细胞核图像下会显示一个 参数 值。首先在 参数 窗口中选择需要 显示 的 参数 项，然后在 图像显 示 窗口中选择 选项 标注 （见 页 下图） ，这样细胞核图像下显示的就是选定的 参数 值。通常我们会选择 DNA_Index。有些操作者也会使用选项 放大 命令来查看大图像，可以看得更清楚，但每页显示的细胞核数目更少。通常，把 图像显示 窗口最大化以便显示尽可能多的细胞核图像。 细胞图谱上选择 选项 降序排列 ， 可以 将细胞 核按显示参数大小 降序排列 ，升序则相反 。 窗口下面 有一排功能按钮，前面 4 个为翻页键， 1、 4 分别为最前、最后页。彩色的按钮为 细胞

48、核分组显示键 ， 点击可在 显示 全部与某组 之间切换， 分割轮廓显示按钮 可显示当前窗口全部细 胞核分割轮廓。 - 28 - 1.6 细胞核图像 /分割 轮廓显示 通过 核图像 放大 ， 可以 打开 细胞核图像 /分割 轮廓显示 。 （图 见下页 ） 并不是每个人都会选择用这个窗口。这个窗口最主要的 作用 是 通过 调整 其 大小 可以看到 经 放大的 细胞 核 的细节 ，同时也可以看到设备分割细胞核轮廓的情况， 由此 来判定是否为重叠细胞核 ， 是否要删除。 “ 分割 轮廓 ” 和图像的形状 一致 ， 则 代表设备 正确 识别图像边界并将其进行 “ 分割 ” ， 其 所 有 参数 值都是根据分割 轮廓 之内部分计算得出。通过点击 图像显示 窗口右下方倒数第二个按钮，也 可以在窗口中互换显示细胞核图像或细胞核分割后的轮廓。 刷新细胞核参