1、A prototype tissue engineered blood vessel using amniotic membrane as scaffold,何 孟 2012年12月6号,1,研究简介,2,实验材料和方法,实验结果,讨论与结论,3,4,目 录,基于薄片的TEBV,天然支架TEBV,1986年开始使用 利用活体血管细胞和天然基质分子 已有多例报道 存在力学性能问题,包含活的纤维母细胞和组织良好的基质天然蛋白 收获和种植细胞花费时间，限制应用,1.1方法比较,一 . 研究简介,1.2 选材及原因,去表皮化的AM无免疫源性，且它在眼部手术，表面移植的通畅性，已经在临床上得到验证,对于
2、促进上皮细胞粘连有重要作用,以AM为基质的培养的EC相应的表达更多的血管内钙连蛋白和整合素,种植在AM上的内皮细胞（EC）的选择素E和选择素P的表达降低（相对于在培养皿培养），相应的其对于白血球的黏附也相应减少,AM（羊膜）,证明戊二醛交联的AM.可以缩短TEBV的合成时间并能解决内皮细胞对于TEBV的黏附问题,将AM做成管状 用戊二醛交联,用猪血管内皮 对材料进行内皮化,在一定时间和生物条件下 通过不同剪切力处理 对细胞黏附进行表征,戊二醛交联,内皮化,剪切力 影响,1.3 实验思路,二 .方法和材料,2.胰蛋白酶消化，刮去EC,1.PBS无菌洗涤,4.绕在聚四氟乙烯棒上,3.无菌水冲洗，切
3、块,6.甘氨酸中和,5.戊二醛交联,8.4无菌保存,7.双蒸水冲洗,交联AM管,AM棒,去上皮的AM,人的AM,AM的获取,2.1 AM的准备 和支架制备,2.2 细胞培养,猪动脉上皮细胞的提取（步骤同前）,甘氨酸处理后，低速离心获得细胞,M199重悬后传代培养（1:3传代）,取P2，P3代细胞进行实验,4,1,2,3,2.3 TEBV的剪切力测试,生物反应器构成,剪切力计算公式,：剪切力（达因每平方厘米） 1 达因 = 10-5牛 ：培养液粘稠度d : TEBV的内壁直径Q :流速（立方厘米每秒） 通过流速控制剪切力大小,测试及检验方法,2.4 免疫荧光染色,肌动蛋白 用 Alexa Flu
4、or-phalloidin 染色 PECAM-1(血小板内皮细胞黏附因子-1)，用小鼠抗大鼠CD31抗体结合， 再用与 与荧光蛋白结合的山羊抗小鼠IgG蛋白染色 VE-钙粘蛋白：用大鼠抗猪的CD144抗体结合，再用 德州红共轭的山羊抗小鼠IgG蛋白染色 整合素1：小鼠抗猪整合素1的抗体结合，再用荧光蛋白结合的山羊抗小鼠蛋白染色 细胞核：碘化丙啶染色共聚焦显微镜和荧光显微镜观察,2.5 蛋白印迹分析,EC细胞蛋白的SDS-PAGE电泳 转移到PVDF膜 脱脂牛奶封闭小鼠抗大鼠PECAM-1抗体标记 PECAM-1 小鼠抗猪VE-钙粘蛋白标记 VE-钙粘蛋白HRP（辣根过氧化物酶）结合的IgG二抗
5、标记显色分析,2.6 统计学分析,t分布检验 选取显著值P0.05 标准误的方法表示结果（SEM）,三 .实验结果,3.1 剪切力的影响,内皮化,剪切力 处理,观察,结果,取制备好的 AM管 用猪的内皮 细胞进行内皮化 培养两天,实验组用在 有剪切力的情况下培养四天 对照组培养相同时间,进行核染色计数 随机抽样计数,经显微观察细胞数目 无明显变化,3.2 免疫荧光研究,肌动蛋白和细胞核染色肌动蛋白：绿色 细胞核：红色,显示出了细胞的方向性,3.2 免疫荧光研究,PECAM-1和VE-钙粘蛋白的分布和表达分析PECAM-1 ：蓝色 VE-钙粘蛋白：绿色,PECAM-1和VE-钙粘蛋白的分布性差异
6、,3.2 免疫荧光研究,整合素1的分布和表达分析整合素1 ：蓝色 细胞核：红色,A-F显示：静止培养时只在AM与EC作用面表达，剪切力影响下，出现其在细胞间的表达量,3.3 蛋白印迹研究,分别增长 729%677%,3.3 蛋白印迹研究,增长259%,激活的整合素却有降低,整合素v3的分布和表达分析整合素v3 ：蓝色 细胞核：红色,A-F显示：剪切力对其分布无影响,整合素v3的表达分析,分别增加298% 和 5313%其中 P0.05,AM作为TEBV合成材料的优势,AM最大承受腔内压力300mmHg,材料合成周期短,AM与细胞的黏附性良好，促进黏附因子表达,基质凝胶蛋白存在力学性能缺陷,基于
7、薄片的组织工程相对耗时,四 .结果与讨论,PGA黏附的EC会被血流冲刷脱落,人工聚合物和天然基质在移植时经常出现内皮细胞脱落问题,生物相容性已得到临床验证,关于测得-肌动蛋白含量减少的解释,但是其他黏附因子的相对含量仍有升高,-肌动蛋白含量显示较少,剪切力处理提高了PECAM-1和VE-钙粘蛋白的表达量,剪切力处理,剪切力处理后，EC比较难从AM上用解离下来，需要更长的解离时间。同时解离出来的细胞可能含有AM的成分 并可能稀释了-肌动蛋白,TEBV移植后的平滑肌细胞的迁移和重塑成型过程因为移植平滑肌细胞可以增加TEBV的机械性质但是自体平滑肌移植需要相当多的时间又有人通过动物实验证明，在植入物植入后，附近的平滑肌细胞会迁移到移植物内,后续研究,选文原因,剪切力方法的设计是一个新思路 选取了几种有代表性的细胞表面因子进行考察，方法全面，实验设计严谨，效果明显 不足：没有对讨论中涉及的其他材料进行平行实验进行对照，没有解释为什么激活的整合素在剪切力处理后降低,
