1、第十七章 研究差异表达基因的相关技术,？基因的差异表达高等真核生物的基因组一般具有3000040000个基因，而每一个细胞大约只表达其中的15%。基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律提供了依据。,第一节 概述,一、研究差异表达基因的目的和意义目的：一是筛选与疾病发生相关的功能基因；二是作为功能基因组学的一部分内容，深入研究基因组中所有基因的功能。,意义从基因水平揭示疾病的发生机制，探索治疗疾病的有效方法。,1.同时显示和研究多个基因在细胞正常和异常状态下的表达水平
2、差异显示反转录PCR技术 DDRT-PCR Differential display RT-PCR消减杂交技术 SH Subtractive hybridization,2.同时展示细胞在特定状态下的表达图谱，又能显示哪些差异表达的基因基因芯片技术 DNA chip基因表达系列分析 SAGE Serial analysis of gene expression,二、研究差异表达基因的主要方法,筛选差异表达基因有2个层次： mRNA protein,（一）基因芯片技术,DNA chipcDNA微阵列杂交技术cDNA microarray hybridization,基因芯片基 本 原 理,Cy3
3、: 550 nm,Cy5: 650 nm,No differential expression,Induced,Repressed,拟南芥,（二）基因表达的系列分析,SAGEserial analysis of gene expression SAGE技术由Dr. Kinzler 在1995发表 (Science 270:484-487)，是近几年来发展起来的一种快速分析基因表达信息的技术。,serial analysis of gene expression,从mRNA (transcript)某一特定位置分离一段910bp的寡核苷酸序列标签(sequence tag，ST)9bp片段可区分
4、262144种mRNA双标签序列(ditig)，锚定酶(anchoring enzyme,AE)，标签酶(tagging enzyme,TE)多联体克隆到一个载体中多联体进行序列分析计算机处理，确定每一种序列(ST)代表转录产物的种类和出现频率,oligo dT磁珠,NlaIII酶（AE）,标签酶识别序列的接头A,BsmFI酶（TE）,PCR扩增,NlaIII酶（AE）,串联体,克隆测序,1. 将5g含有oligo dT（引物）的磁珠与RNA混合。2. 合成双链cDNA。3. 用Nla酶（AE）消化形成一条链末端有标记的产物。4. 将样品分成两份，连接成含有标签酶识别序列的产物，以备用BsmF
5、1（TE）消化。5. 用BsmF切割每一个样品形成50bp的标签。6. 混合2个反应体系，延伸5秒，连接成100bp的双链标签。7. PCR扩增。8. 用Nla酶切40bp产物释放26bp双链标签。9. 连接片断形成串联体。10. 克隆到pZErO-1+里，并测序。,Example of a concatemer:,CATGACCCACGAGCAGGGTACGATGAT TAG 1 TAG 2 CATGGAAACCTATGCACCTTGGGTAGCA TAG 3 TAG 4 CATGTAGGACGAGGGTGGACAATGCTCATG TAG 5 TAG 6,（三）差异显示PCR方法,该方法的
6、创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3-锚定引物，其通式为5-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列；在5端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。,DDRT-PCR的主要步骤：,.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA；.用5随机引
7、物和某个3端锚定引物对扩增第一链(掺入32p-dNTP)；.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；.回收特异性差别条带；.用同一引物对扩增已回收的DNA条带；.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。,poly(A)尾巴5上游的2个碱基只能有12种可能的排列组合,缺点：240个引物对，至少要扩增240次，配对的样本越多，PCR次数越多；PAGE电泳只能分离小于500bp片段，每一泳道最多分析50100条；Northern印迹繁杂，费时，费力；缺少定量分析手段；假阳性高，可以高达90% 。,在1994年，I
8、to等对3端锚定引物的设计由固定两个碱基变为一个碱基固定的引物，这就使原来12种引物减至3种即可(512，512，512)，这样做减少了每个mRNA样品对逆转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些的代表性差和RNA数量过多现象降低到最低程度；在随后的两年中，研究人员有在3端引物和5随机引物末端分别加上了限制性内切酶识别位点(如Hind III酶切位点)，使得5端引物条数改为8条，长度为13bp，而3端引物则由18个碱基组成。这样形成的24种引物对，经计算机同源性分析表明同样能覆盖全部mRNA，使实验简化，同时由于引物变长，使cDNA扩增更为有效。,（四）消减杂交法,将实验组mRNA与对照
9、组cDNA杂交，或将实验组cDNA与对照组mRNA杂交，去除杂交体和未杂交上的对照组成分，得到的为实验组独有的mRNA或cDNA，这些基因即为差异表达基因。,代表性差异分析技术 RDA Representational difference analysis抑制消减杂交法 SSH Suppression subtractive hybridization基于PCR的消减杂交法 PCR-based subtractive hybridization,RDA基本原理是,检测DNA（Tester，T）和驱动DNA（Driver，D）的cDNA在进行差示分析前均用一种识别4碱基序列的限制酶作切割处理，
10、形成平均长度为256bp的cDNA片段代表群；第一次T与D杂交反应时，两者总量比为1:100, 第二次增加到1:400，第三次增加到1:8000；再利用PCR以指数形式扩增双链模板，而仅以线性形式扩增单链模板这一特性；,通过降低cDNA群体复杂度和多次更换cDNA两端接头，来实现特异扩增目的基因片段的目的。特别是T减D杂交反应后仅设置了72复性与延伸及95变性这两个循环参数，共进行20次循环，从而使PCR产物特异性显著提高。,1.用DpnII或Sau3AI限制性内切酶分别消化两组双链cDNA；2.两端接上双链接头R，补平后，用含接头R序列的引物，PCR扩增；3.再用DpnII或Sau3AI限制
11、性内切酶分别消化两组双链cDNA两端的接头R；4.仅实验组双链cDNA两端再接上单链接头J，3端；,5.将实验组与驱动组cDNA杂交，用含接头J序列的引物，进行PCR；6.只有实验组自身杂交体以几何级数扩增，而实验组与驱动组形成的杂交体以线性扩增，驱动组自身的杂交体不扩增。7.将第一次扩增产物再行第二轮酶切、加接头、杂交和PCR扩增。重复2次后，可确保从实验组中彻底去除与驱动组共有的序列。,这种方法mRNA用量少，特异性高，但有如下缺点：实验组低丰度的分子检出率低；酶切连接步骤多，cDNA会损失多，可以漏掉关键基因；得到是酶切片段。,抑制消减杂交法 SSH,Suppression subtra
12、ctive hybridization是1996年Diatchenk L等提出的一种新的克隆差异表达基因的新技术；是一种简便有效、以抑制PCR和消减杂交为基础的分离差异表达基因的新技术。分离两组基因表达差异较小的基因；,该技术的操作流程包括两轮杂交和两轮PCR扩增，可以有效扩增目的cDNA片段。抑制性杂交技术克服了消减杂交技术无法克隆低丰度表达基因的缺陷，并且降低了假阳性率，相对于其它差异显示技术具有很大的优越性。,SSH基本步骤是,制备两种样本的mRNA，合成双链cDNA，分别作为T cDNA和D cDNA；先将T与D方cDNA用限制酶切割为平末端小片段；将T方平均分为两份，分别连接接头1与
13、接头2；接头1：为长链，40nt，其3与cDNA5连接；其外侧序列与第一次PCR引物序列互补，内侧序列与第二次PCR引物序列互补；接头2：为短链，10nt；2个接头均含有T7启动子和内切酶识别序列；而且具有反向末端重复序列。,第一次差减杂交：2份T分别与过量的D方cDNA进行不充分杂交。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅速复性，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在，这样各种单链分子在浓度上基本相同。第二次扣除杂交：然后混合两份杂交样品，同时加入新的过量D方cDNA进行杂交；经丰度均等化和消减的单链检测和驱赶cDNA形成各种双链分子，又进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分
14、子(e)；第一次PCR：杂交完全后补平末端，加入合适的接头引物（接头1与接头2的外测引物）进行PCR扩增。当DNA两条链含相同接头时，其PCR扩增受抑制，而含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增，其产物即为目的片段。,选用一对与接头序列内侧相同的引物进行第二次PCR；构建cDNA文库：用合适的内切酶酶切PCR产物，插入适当的载体，转化细菌，经X-gal蓝白斑筛选出重组体。再经探针杂交找出具有差别表达的cDNA片段；最后对这些cDNA片段，进行序列测定、序列同源分析等进行完整基因的克隆、鉴定。,此技术避免了消减杂交过程中分离单双链DNA的步骤，可成千倍地扩增目的片段，能分离出T方上调表达的基
15、因，与DDRT-PCR相比；具有假阳性少、重复性强、敏感性高的优点；它的最大不足就是需要较多的起始材料，更多依赖于PCR技术，不能同时进行数个材料之间或不同处理材料之间的比较，获取的片段较短小，给后续的处理带来不便。,Tester A,Driver (in excess),a, b, c, d+ e,III,IV,V,a, d no amplificationb no amplificationc linear amplificatione exponential amplification,cDNA synthesis,ds tester cDNAds driver cDNA,Poly A+
16、 RNA,Rsa I digestion,a,b,c,d,abc,d,e,I,II,Fresh denatured Driver,Tester B,A: ss testers, include equal concentrations of high and low abundance sequences (*)B: Complementary sequences (reannealing of the tester dsDNA).C: Common non-target cDNAs.D: driver sequencesE: ds tester with different ss ends
17、that correspond to Ad1 and Ad2R,Structure of mRNA,Whats RsaI,Stage I,Stage II,Normalization,Suppression PCR,(Diatchenko et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:6025 ),SSH 應用原理,Suppression Subtractive Hybridization ( SSH ) 抑制性雜合扣除法,第二节 基于PCR的消减杂交技术,PCR-based subtractive hybridization 赵忠良 男，博士，第四
18、军医大学副教授，创建了基于PCR的减法杂交技术。,基于PCR的消减杂交技术的基本原理,1.实验组cDNA 利用tester mRNA的3poly A尾和5-GGG帽子结构分别在cDNA两端加上序列相同的锚定引物；2.扣除组cDNA 将driver cDNA进行随机引物PCR扩增制备扣除探针，同时掺入生物素(Biotin-11-dUTP)；3.将实验组的cDNA与参有生物素的扣除探针进行液相杂交；,4.用连有亲和素的磁珠吸附掉杂交液中杂交体及未杂交上的扣除探针，得到实验组独有的cDNA；5.用锚定引物将其扩增；6.扩增产物克隆。,基于PCR的消减杂交法PCR-based subtractive
19、hybridization,Tester,Driver,AAA,GGG,AAA,GGG,TTT,CCC,TTT,逆转录,逆转录,mRNA,cDNA,锚定引物PCR,随机引物PCR含生物素-dUTP,Drive probe,液相杂交,用含链亲合素 的磁珠除去,未杂交的cDNA,杂交的cDNA未杂交的探针,克隆、测序,这种方法最大的好处是：起始材料需要少，可获得差异基因，可扩增到低丰度的cDNA，假阳性少，有可能获得全长差异表达基因。,实验流程,获得实验组和对照组的样品,分别提取实验组和对照组的mRNA,对于实验组，采用带锚定序列的反转录引物和3锚定引物(3GGG)进行反转录，得到全长cDNAs,
20、对于扣除组，采用Olig dT作为反转录引物，进行普通反转录，得到cDNAs,对扣除组cDNAs进行随机PCR扩增，掺入生物素Biotin-dUTP，产物即为标记好的扣除探针,实验组cDNA与扣除探针杂交,用Sephacryl S-400柱纯化杂交产物,用连有链亲和素磁珠吸附除去杂交体和扣除探针,通过PCR对目的片段进行特异性扩增,将目的片段克隆到载体,通过反向点杂交初步排除假阳性克隆,对阳性克隆进行序列分析,通过Northern杂交进一步验证差异基因,对差异基因作进一步的分析和研究,对于已知基因,通过检索分析该基因在本疾病模型中的意义,观察该基因在本疾病病理组织中的表达分布特点,通过外源转染或抑制该基因的表达，看该基因在本疾病模型细胞中的作用,对于未知基因,克隆其全长cDNA，并得到序列，推测蛋白质的氨基酸序列,克隆并得到基因组全序列，研究该基因在染色体上的定位和拷贝数,基因的组织分布和细胞内定位研究,基因表达产物的功能分析，如通过外源转染或抑制该基因的表达，看该基因在细胞中的作用,
