1、防腐剂检测方法,主讲人：杨海朝,防腐剂知识介绍,1、防腐剂的作用 ：防止食品因微生物而腐败变质，控制细菌生长，延长食品保藏期， 它也可防止微生物中毒（亦可称为抗微生物剂）。 2、防腐剂的分类： 有机化学防腐剂：苯甲酸钠、山梨酸钾、苯甲酸、山梨酸、丙酸钠、丙酸钠、对羟基苯甲酸乙脂、丙脂和脱氢醋酸。无机化学防腐剂：亚硫酸盐、亚硝酸盐、二氧化硫和焦亚硫酸盐。,苯甲酸简介,苯甲酸又名安息香酸，因其在水中的溶解度较低，多使用其盐苯甲酸钠。苯甲酸及其盐在酸性环境中对多种微生物又抑制作用，但对产酸菌作用较弱。在PH5.5以上时对很多霉菌和酵母菌的作用也较差。其抑菌作用的PH值为2.5-4.0。一般以低于4.
2、5-5为宜。由于它们需要在酸性环境中通过未解离的分子起抗菌作用，故称酸性防腐剂。 苯甲酸进入机体后大部分与甘氨酸结合成马尿酸，其余部分与葡萄糖醛酸结合成葡萄糖甘酸，并全部从尿中排出体外。苯甲酸不在人体内蓄积。 苯甲酸及苯甲酸钠可引起过敏反应。苯甲酸对皮、眼睛和粘膜有一定的刺激性；苯甲酸钠可引起肠道不适。,山梨酸简介,山梨酸又名花楸酸，是近年来各国普遍许可使用的安全性较高的防腐剂。因其在水中溶解度较低，实际使用时多为山梨酸钾。 山梨酸及其钾盐对霉菌、酵母和需氧菌均有抑制作用。但对厌氧芽孢杆菌与乳酸杆菌几乎无效。山梨酸的防腐效果随PH值升高而降低，但适宜的PH值范围比苯甲酸广，以在PH5-6以下使
3、用为宜，亦属酸性防腐剂。 山梨酸是一种不饱和脂肪酸，在体内可参加正常脂肪代谢，最后被氧化成二氧化碳和水，故几乎没有毒性只是对皮肤稍有刺激 。 山梨酸的毒性比苯甲酸小，抑菌作用的适宜PH值范围比苯甲酸广，故有取代苯甲酸的趋势。,检测防腐剂的目的,从以上知识介绍当中可以看出，防腐剂虽然毒性不是很高，但是使用过量会对肠道造成伤害和造成消化系统病变。所以应把防腐剂控制在一定范围内，防止食品中防腐剂浓度过高而加重对肠道等消化系统的损坏。,防腐剂检测原理,将样品用NaOH浸泡，通过半透膜的隔离使大分子物质留存在半透膜内，而苯甲酸和山梨酸作为小分子通过对样品的长时间浸泡在膜内和膜外达到平衡。,试剂,1、甲醇
4、（色谱纯） 2、乙酸铵（优级纯） 3、冰乙酸（分析纯） 4、重蒸水（或纯水） 5、苯甲酸（分析纯） 6、山梨酸（分析纯） 7、氢氧化钠（分析纯）,仪器及易耗品,仪器1100 HP液相色谱仪、比色管、移液管、旋涡混合器、抽滤装置 仪器条件：检测器：DAD检测器色谱柱：Elipse DB-C8 4.6 150mm进样器：自动进样器柱 温： 25泵类型：四元泵脱气机：真空在线脱气机 易耗品： 半透膜、0.45m滤膜,测定条件,流动相条件：甲醇乙酸铵溶液（0.02mol/L）=3 7（用冰乙酸调PH=3）。 检测器条件：选择2个检测通道分别为：波长230nm和波长255nm 流速：1.0ml/min
5、进样量：10L,操作步骤（样品处理）,1、配制0.02mol/L NaOH标准溶液：用500ml量筒量取400ml浓度为0.05mol/L NaOH标准溶液注入1000ml无色容量瓶中，用纯水定容，摇匀备用。 2、用半透膜对折放入烧杯中。 3、在半透膜中称3-4g样品，然后在半透膜的内外各加15.00ml浓度为0.02mol/L的NaOH标准溶液，浸泡过夜。 4、用移液管移取半透膜外的溶液10.00ml于50ml比色管中，然后加入5ml流动相稀释。 5、用旋涡混合器将以上样品混合均匀，用双层针型过滤器过滤入样品瓶内，待测。,操作步骤（苯甲酸标液的配制）,100ppm苯甲酸标准溶液的配制： 1、
6、用50ml的烧杯称取苯甲酸标样0.0050g（ 最好用十万分之 一天平称量），加入适量流动相用玻璃棒搅拌溶解 （也可用超声波震荡器震荡混匀）。 2、将上述溶液倒入50ml容量瓶中，再用少量 的流动相冲洗烧杯4次以上，一并倒入50ml容量瓶中，最后用流动相定容、摇匀。 3、用双层针型过滤器过滤入样品瓶内，待测。,操作步骤（苯甲酸和山梨酸混合标样的配制）,100ppm苯甲酸和山梨酸混合标准溶液的配制： 1、用 50ml 的烧杯称取苯甲酸和山梨酸标样各 0.0100g（ 最 好用十万分之一天平称量），加入适量流动相用玻璃棒搅拌溶解 （也可用超声波震荡器震荡混匀）。 2、将上述溶液倒入100ml容量瓶
7、中，再用少量 的流动相冲洗烧 杯4次以上，一并倒入100ml容量瓶中，最后用流动相定容、 摇匀。 10ppm苯甲酸和山梨酸混合标准溶液的配制： 1、用5ml的移液管移取上述100ppm混合标准溶液5.00ml于50ml 容量瓶中，用流动相定容、摇匀备用。 将上述两种浓度的标准溶液用双层针型过滤器过滤入样品瓶内，待测。,操作步骤（流动相的配制）,冲柱流动相的制备： 1、甲醇（色谱纯）：用0.45m的油性滤膜过滤，倒入A瓶中备用。 2、纯水：用0.45m的水性滤膜过滤，倒入D瓶中备用。 0.02mol/L乙酸铵溶液的配制： 1、用万分之一分析天平称取1.54g乙酸铵（优级纯）于1000ml 容量瓶
8、中，加入适量的纯水平摇使乙酸铵充分溶解，然后用纯水定容。 流动相的配制： 1、用500ml量筒分别量取300ml甲醇（色谱纯）和700ml0.02mol /L乙酸铵溶液于1000ml烧杯中，加入冰乙酸4ml，用玻璃棒 搅拌均匀。用水性滤膜过滤，倒入B瓶中备用。,操作步骤（仪器的操作1）,1、流动相注入试剂瓶中，同时配制10%的异丙醇溶液倒入淋 洗瓶中并将淋洗阀门打开。 2、打开计算机，将CAG Bootp Server 最大化，打开HP1100液 相色谱系统开关，等待BOOTP 窗口收到信息，说明系统与计算机自检完毕。将CAG Bootp Server 最小化，并打开 ONLINE图标，启动化
9、学工作站。 3、在view中进入method and run control界面，在method菜单下找到edit entire method并输入方法信息、仪器参数和采集参数、数据分析参数、运行时间表等内容。 4、在method菜单下点击save method as对编辑的方法进行保存，并输入编辑文件方法名。,操作步骤（仪器的操作2）,1、在Load method调出所要运行的方法。 2、手动打开Puge阀，按逆时针方向旋转2-3圈，点击右下角的 ON 按钮启动高压输液泵，设置泵流量为5ml/min，待废液 管中无气泡流出，将泵流量设回1ml/min，将Puge阀关闭。 3、先用5：95的甲
10、醇和水冲洗系统，等系统稳定后（一般要1 小时），换成所要使用的流动相使系统重新达到平衡。 4、在run control菜单中，点击sample info输入样品信息,输完后，点击左下角的OK键，完成样品的数据信息保存。 5、将处理好的样品，放入样品盘中，等待测定。 6、在 run control菜单中，点击run method栏，对样品进行测定。,操作步骤（数据处理）,1、调出图谱：在File菜单下，选择 load signal在 data数据文件，找到所要分析的数据文件。如果确定图谱在哪个信号下效果最好，可直接选择信号栏 ，点击所要选择的信号，然后点击OK键，即可调出图谱。 2、优化图谱 ：
11、在Graphics菜单下，选择signal options栏选择图谱的范围及图谱的输入方式，然后点击OK键，即可优化图谱。 3、优化积分：在Integration菜单下，点击 AUTO Integrate进行自动积分。然后，在 Integration菜单下点击Integration events栏，屏幕出现优化积分信息，然后按照自己的意图进行积分的优化，优化完毕，点击优化积分部分左上角的的退出按钮，退出优化积分。 4、报告编辑：在Report菜单下，点击Specify Report栏，选择显示方式、报告类型、输出内容、打印页数、图谱横坐标所占报告的比例，修改完毕，点击键，即完成报告格式的编辑。如果需打印，则在Report菜单下，点击Print Report,即可将所编辑的报告打印输出。,计算,1、计算方法：外标法 2、计算公式：C= Cs45C：样品浓度（ppm）Cs：标样浓度（ppm）A1：样品峰面积A2：标样峰面积45：稀释倍数m：称样量,
