1、生物制药工艺学,在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？,问题：,1、由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降； 2、由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降； 3、杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的pH值，从而使生物反应发生异常变化； 4、杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败； 5、发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败，等等,杂菌污染的后果：,设备无死角，没有构成染菌可能的因素 对生产环境和培养基进行严格的消毒和灭菌 好氧发酵过程应通入无菌空气。,如何实现纯种培养
2、,5,注意： 空气除菌不彻底是发酵染菌的主要原因之一 。比如一个通气量为 40m3/h 的发酵罐, 一天所需要的空气量高达 960m3, 假如所用的空气中含菌量 104个/m3, 那么一天将有 9.6106个微生物细胞进入发酵系统, 这么多杂菌的带入, 完全可导致发酵失败。,灭菌：指利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。 消毒：是指用物理或化学的方法杀死物料、设备、器具内外的病源微生物, 一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。,灭菌和消毒的概念,注意： 在工业生产中, 为了保证纯种培养, 在生产菌种接种之前, 要对培养基
3、、消泡剂、流加物料、空气系统、设备、管道等进行灭菌, 还要对生产环境进行消毒, 防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。,化学物质灭菌 辐射灭菌 过滤介质灭菌 热灭菌，包括干热灭菌和湿热灭菌,工业中常用的灭菌方法,原理：某些化学药剂能与与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性、酶失活。 常用的灭菌剂：新洁尔灭（苯扎溴铵）、杜灭芬、高锰酸钾、漂白粉、酒精、甲醛、戊二醛、过氧乙酸等。 使用范围：器皿、双手以及实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌。,化学试剂灭菌法,原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。 常用：紫外线、X射线和射线。（波长在260nm左右的紫外线灭菌效果最高） 紫外
4、线：对微生物有高度致死效应，主要是与菌体核酸的光化学反应 而造成菌体死亡。对营养细胞和芽孢均有效。但穿透力低，只适于表 面灭菌。X射线和射线:使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反 应，阻碍微生物代谢活动而导致菌体迅速死亡。虽然灭菌效果好，但 穿透力强，不安全不经济。 使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌。对固体物料灭菌不彻底, 也不能用于液体物料的灭菌。,辐射灭菌法,原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。 方法： 0.01-0.45um孔径滤膜 使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气, 供好氧微生物培养过程使用。,过滤介质除菌法,原理：利用高温
5、对微生物有氧化作用，蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。 常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180 1-2小时。 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌 。,干热灭菌（包括火焰灭菌、烘箱灭菌）,包括巴氏灭菌、间歇灭菌、高压蒸汽灭菌 原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性而使微生物死亡。 常用方法：水煮常压灭菌 100饱和蒸汽灭菌 一般121 30min 使用范围：培养基和发酵设备灭菌。,湿热灭菌,接种针、试管口 环境空气、皮肤表面 无菌室、接种箱 培养基的灭菌 空气,过滤除菌法 火焰灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学试剂灭菌法,营养细胞、芽孢、病毒或孢
6、子,比较各种微生物对热的抵抗能力大小,灭菌方法连线题,（一）分批灭菌（实罐灭菌）培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其它装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。这种方法不需要其他的附属设备，操作简便，是国内外生产中常用的方法。但加热和冷却时间较长，营养成分有一定的损失，罐利用率低，不能采用高温快速灭菌工艺,培养基的灭菌方法,过程包括：升温、保温和冷却等三个阶段。 各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%,从以上分析可知，灭菌过程中加热和保温阶段的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不计。此外，还应指出的是，应当避免长时间
7、的加热阶段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。,各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%,在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高的情况，这时可以适当延长灭菌时间。 生产上甚至有用100蒸煮而达到彻底灭菌的实例。 如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用100蒸汽蒸30min，杀死其中的营养细胞， 但孢子与细菌的芽孢没有被杀死。 将蒸过的原料置于室温下过夜， 未被杀死的孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细胞，再30min便可杀死。如此连续反复进行2-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。,优点：无需专一灭菌设备，但易发生局部
8、过热而破坏营养成分的现象。 适用条件：当培养基中含有固体颗粒或培养基有较多泡沫时，以采用分批灭菌为好。对于容积小的发酵罐，连续灭菌的优点不明显，而采用分批灭菌比较方便。,（二）连续灭菌培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐的工艺过程。特点：1.迅速，损失少。2.发酵罐非生产占用时间少，容积利用率高。3.自动化，热能利用率合理。4.不适用于粘度大和固形物含量高的培养基。,22,预热加热（126-132）维持冷却,连续灭菌过程,培养基升温到70 ,A 塔式加热器 B 喷射式加热器,A 罐式保温设备 B 管式保温设备,A 喷淋冷却式 B 真空冷却式 C 薄板冷却式,
9、发酵罐,蒸汽,蒸汽,冷却水,无菌培养基,配料罐,泵,加热塔,维持罐,冷却管,连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50后，输送到预先已经灭菌过的罐内。,连续灭菌
10、示意图,间歇灭菌与连续灭菌的比较,加热器、维持罐（管）和冷却器以及发酵罐等都应先进灭菌,(1) 培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性, 高浓度有机物会包于细胞的周围形成一层薄膜, 影响热的传递, 因此在固形物含量高的情况下, 灭菌温度可高些。例如, 大肠杆菌在水中加热 6065 便死亡；在 10% 糖液中, 需 70 46min；在 30% 糖液中需 70 30min。 (2) pH 值 pH 值对微生物的耐热性影响很大。pH 值 6.08.0, 微生物最耐热；pH6.0，氢离子易渗入微生物细胞内, 从而改变细胞的生理反应促使其死亡。所以培养基 pH 值愈低, 灭菌所需的
11、时间愈短。,影响培养基灭菌的因素,(3) 培养基中的颗粒 培养基中的颗粒小, 灭菌容易, 颗粒大, 灭菌难。一般含有小于1mm 的颗粒对培养基灭菌影响不大, 但颗粒大时, 影响灭菌效果, 应过滤除去。 (4) 泡沫 培养基的泡沫对灭菌极为不利, 因为泡沫中的空气形成隔热层,使传热困难, 热难穿透过去杀灭微生物。对易产生泡沫的培养基在灭菌时, 可加入少量消泡剂。对有泡沫的培养基进行连续灭菌时更应注意。,无菌检查（一）无菌试验1.肉汤培养法 2.斜面培养法 3.双碟培养法（二）染菌的判断1.连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化或浑浊。2.双碟上连续3个时间样品长出杂菌3.检查样品保留，以备长期
12、监测。一般12小时后。,无菌检查与染菌处理,染菌的处理（一）污染杂菌的处理1.种子罐的处理2.发酵罐的处理3.染菌后设备的处理（二）污染噬箘体的处理噬菌体污染后发酵液转稀，泡沫增多，早期镜检发现菌体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶，最后仅残留菌丝片段，平皿中出现典型的噬菌斑，营养成分很少消耗，产物合成停止。处理方法：发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉，严防发酵液任意流失；全部停产，对环境进行全面的清洗和消毒，断绝噬菌体的寄生基础；更换生产菌种，筛选抗噬菌体的菌种，防止重复污染。,防止染菌的措施设备方面：要求发酵罐及其附属设备应做到无渗漏， 无死角。凡与物料、空气、下水道连接的管件都应保证 严密不漏
13、，蛇形管和夹套应定期试漏。 空气净化系统方面：提高空气进口的空气洁净度，除尽 压缩空气中夹带的油和水，保持过滤介质的除菌效率。 定期检查更换空气过滤器过滤介质，使用过程中要经常 排放油水。 工艺方面：放罐后要进行全面检查清洗。（清理罐内残 渣，去除罐壁上的污垢等。）空罐灭菌时要排尽罐内空气，灭菌时保持蒸 汽通畅，保证灭菌彻底。实罐灭菌时要防止原料结块。进入发酵罐的物料要保证无菌。严格按照操作规程执行。,阀门试漏的方法,法兰连接的死角,渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角,不锈钢衬里的死角,接种管路的死角,如下图a所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角 解决办法：装设旁通（小放气阀）,排气管的
14、死角,压力表安装不合理形成的死角,分批培养（batch culture or fermentation）分批培养是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。,特点： (1)整个培养系统与外界没有其它物质交换（O2、CO2、消泡剂、酸碱除外） (2)整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度不断变化，是一种非稳态的培养方法。,问题,为什么说微生物分批培养是一种非稳态的过程？,在分批培养过程中，随着微生长细胞和底物、代谢物的浓度等的不断变化，微生物垢生长可分为停滞期、对数生长期、稳定期和死亡期等四个阶段。,分批培养
15、的优缺点,优点: 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握。 缺点: 存在基质抑制的问题，产率低，不适宜测定动力学数据。,连续培养（continuous culture）连续培养是指微生物培养到对数生长期 时，在发酵罐中不断添加新鲜的培养基，同时 不断放出代谢物，使微生物细胞在近似恒定状 态下生长的培养方式。 特点：菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度 均处于恒定状态。,连续培养的优缺点,优点: 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，产量高。 缺点: 长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。染菌机会增加。 应用：废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。,补料分批培养（fed-batch culture）介于分批培养和连续培养之间的操作方法。补料分批培养是指根据菌体生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。,4、补料分批培养的优点,料分批培养是介于分批培养和连续培养之间一种微生物细胞的培养方式，它兼有两种培养方式的优点，并在某种程度克服了它们所存在的缺点。,缺点： (1)由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。 (2)由于物料的加入增加了染菌机会。应用：面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。,
