1、1）发酵罐的灭菌,（在夹套中）关好空气阀门，蒸汽上进下出，冲蒸气，压力大于2 kg/cm2（120），最好是45 kg/cm2（160）。 当罐内温度80，进蒸汽口（蒸气阀）关掉，出蒸汽口（排气阀）关小。打开空气阀门，蒸汽直接进罐，121，2030min。 从80100上升很快，大于100后温度上升很慢，到118时就开始计时，到计时25min时立即关掉蒸汽阀。 关掉蒸汽阀后通入无菌空气，使罐内一直保持正压（高于大气压，空气不会倒灌入罐内）。 （在夹套中）加自来水冷却，从下向上，使温度尽快降到55左右，到3738时关掉水，也有缓冲性。,因为有缓冲性，蒸汽会冲到121。,在80以上冲入蒸汽不容易产
2、生冷凝水，罐内体积不会增加很大，培养基不会被稀释很大。,过程,小型罐 50L7吨用夹套系统冷却；大型罐7吨以上，用冷却管（盘肠、列管系统）。,2）发酵罐的管路和死角的消除,(1)尽量减少管路,单罐多罐,发酵罐的出口越少越好， 出料口和进气管可以合并， 接种管、消泡管、补料管可以合并。 排气管不能合并，易引起交叉污染。,出料前后都要消毒，用活（流动）蒸气消毒； 出料管不能合并；,(2) 消灭死角,管道转弯有弧度 放料管、取料管的阀腔处装小阀,3)发酵罐的管道布置,保证蒸气在管道中畅通，有排气口（小阀），接种管、中间补料管、放料管都要有排气口（小阀）； 避免冷凝水排入已灭菌的罐体或空气，加止逆阀（
3、单向阀）； 灭菌后的管道用无菌空气保压； 蒸气总管道要有分气缸、排气阀、减压阀、安全阀； 相邻罐不联通,连续灭菌也叫连消 培养基采用连续灭菌时，需在培养基进入发酵罐前，直接用蒸汽进行空罐灭菌，用无菌空气保压，待培养基流入罐后，开始冷却。 灭菌时可采用各种加热器。 培养基的冷却方式有喷淋冷却式、真空冷却式、薄板换热器式几种方式，其过程均包括加热、维持和冷却。,2、连续灭菌,喷淋冷却优点是能一次冷却到发酵温度。,培养基冷却方式比较：,真空冷却只能冷却到一定温度，需在发酵罐中继续冷却，但它可以减少冷却用水，占地面积少。,板式换热器效率高，且利用冷培养液作冷却剂，既能冷却了热培养基，又预热了冷培养液，
4、节约用水和蒸汽。,连续灭菌采用连消塔时，可在2030s达到预定灭菌温度，由维持罐来保持必需的杀菌时间。 采用喷射杀菌设备，蒸汽直接喷入生培养液，温度几乎立即上升到预定杀菌温度，由保温段管子的长度来保证必要的杀菌时间。 采用板式换热器，可在20s内达到杀菌温度，经保温保持必要的杀菌时间，然后再板式热交换器另一段20s内冷却到发酵温度。,第四章 无菌空气的制备,（一）空气净化的方法,一般可按103的染菌概率，即在1000次培养过程中，只允许一次是由于空气灭菌不彻底而造成染菌，致使培养过程失败。,热灭菌法 辐射灭菌 静电除菌 介质过滤除菌法,空气净化的方法大致有以下几种：,空气灭菌的目的- 除去空气
5、中的水雾、油雾、尘埃，同时也除去了空气中的微生物,1. 热灭菌法,它与培养基的加热灭菌相比，虽都是加热法把微生物杀死，但两者的本质是有区别的。,鉴于空气在进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力，所以，空气热灭菌时所需的温度，就不必用蒸汽或其他载热体加热，而可直接利用空气压缩时的温度升高来实现。 空气经压缩后温度可升到200以上，保持一定时间后，便可实现干热杀菌。 利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理对制备大量无菌空气具有特别重要的意义。,2、辐射灭菌,利用超声波、紫外线、X射线、射线、射线射线或放射性物质产生的高能粒子破坏蛋白质等生物活性物质进行灭菌，以紫外线最常用。仅适用于表面
6、灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌。,3. 静电除菌,静电除菌时是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。,对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘灭菌对很小的微粒效率较低。,悬浮于空气中的微生物，其孢子大多数带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高压静电场时都会被电离成带电颗粒。,过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。 并有足够的压力和适宜的温度以供好氧培养过程之用。 该法广泛应用，是获得大量无菌空气的常规方法，在生产中使用最多。,4. 介质过滤除菌法,第二
7、节 空气的过滤除菌原理和过滤介质,一、空气的过滤除菌原理,布朗扩散截留作用 拦截截留作用 惯性撞击截留作用 重力沉降作用 静电吸引作用,在过滤除菌中，有时很难分辨上述各种机理各自所作贡献的大小。 一般认为惯性撞击截留、拦截截留和布朗运动截留的作用较大，而重力和静电引力的作用则很小。,二、空气过滤除菌的介质和过滤器,用于空气过滤的过滤介质有纤维状物或颗粒状物、过滤纸、微孔滤膜等各种类型。,1、纤维状或颗粒状过滤介质,棉花-常用的过滤介质，通常使用脱脂棉玻璃纤维-纤维直径小，不易折断，过滤效果好。活性炭-要求活性炭质地坚硬，不易压碎，颗粒均匀，装填前应将粉末和细粒筛去。常用小圆柱体的颗粒活性炭。,
8、2、过滤器的结构,（1）深层棉花（活性炭、玻璃纤维）过滤器,深层棉花过滤器是立式圆筒形，内部充填过滤介质，空气由下向上通过过滤介质，以达到除菌的目的。,填充物按下列顺序安装：在充填介质区间的过滤器圆筒外部有装夹套，作用为在消毒时对过滤介质加热，要十分小心控制，温度过高容易使棉花焦化而局部丧失过滤效率，甚至有烧焦着火的危险。 空气一般从下部圆筒切线方向通入，从上部圆筒排出，出口不宜安装在顶盖，以免检修时拆装管道困难。 过滤器上方装有安全阀、压力表，罐底装有排污孔，以便经常检查空气冷却是否完全，过虑介质是否潮湿等情况。,孔板铁丝网麻布棉花麻布活性炭麻布棉花麻布铁丝网孔板,（2）平板式纤维纸分过滤器
9、,空气从筒身中部切线方向进入，空气中的水雾沉入筒底，由排污管排出，空气经缓冲层通过下孔板经薄层介质过滤后，从上孔板进入顶盖排气孔排出。,三、介质过滤效率,介质过滤效率是指被介质层捕集的尘埃颗粒与空气中原有颗粒数之比。,N1，N2过滤前、后空气中的尘埃颗粒数； 过滤效率，； P穿透率，即过滤后空气中残留颗粒数与原有颗粒数之比。,介质过滤不能长期获得100的过滤效率，即经过滤的空气不是长期无菌。当气流速度达到一定值或过滤介质使用时间长，滞留的带菌微粒就有可能穿过，所以过滤器必须定期灭菌。,介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高。,四、影响介质过滤效率的
10、因素,对于相同的介质，过滤效率与介质滤层厚度、介质填充密度和空气流速有关。介质填充厚度越高，过滤效率越高；介质填充密度越大，过滤效率越高。,五、提高过滤除菌效率的措施,(见书p98) 1、减少进口空气的含菌量 2、安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质 3、设计合理的空气预处理设备 4、保证过滤介质干燥,第三节 空气过滤除菌的工艺技术,空气过滤除菌一般是吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤，然后进入空气压缩机。从空压机出来的空气（一般压力在1.96105Pa以上，温度120150），先冷却到适当的温度（2025）除去油和水，再加热到3035，最后通过总过滤器和分过滤器除菌，从而获得洁净度
11、、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。,（一）空气净化的一般流程,（二）几种典型的空气净化流程,这是一个比较完善的空气除菌流程，可适应各种气候条件，能充分分离油水，使空气达到较低的相对适度下进入过滤器，以提高过滤效率。,1. 两级冷却、加热除菌流程,2. 冷热空气直接混合式空气除菌流程,压缩空气从贮罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理的高温压缩空气混合，此时混合空气已达到温度为3035，相对湿度为5060的要求，在进入过滤器过滤。,3. 高效前置过滤空气除菌流程,采用高效率的前置过滤设备，利用压缩机的抽吸作用，使空气先经中、高效过滤后，再进入空气压缩机，降低了主过滤器的负荷，所得的空气无菌程度很高。,4、将空气冷却至露点以上的流程（p100) 5、利用热空气加热冷空气的流程 6、一次冷却和一次析水的空气过滤流程,（三）附属设备,1. 粗过滤器,安装在压缩空气机前的过滤器，主要作用是捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受磨损，同时也可减轻总过滤器负荷。 要求过滤效率要高，阻力要小。 通常有：布袋过滤，油浴洗涤和水雾除尘等。,2. 空气贮罐,消除压缩机排出空气量的脉动，维持稳定的空气压力； 利用重力沉降作用分离部分油雾； 热杀菌。,作用,3. 气液分离器,作用：分离空气中被冷凝成雾状的水雾和油雾粒子。,
