1、三、全血、血清或血浆中miRNA富集部分的提取。1. 样品处理：每200 l全血、血清或血浆中加入等体积裂解液MZ，振荡器振荡混匀30 sec。2. 室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。3. 室温 12,000 rpm (13,400g) 离心10 min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。4. 加入200 l氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置5 min 。5. 室温 12,000 rpm (13,400g) 离心15 min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作。6. 量取转移液的体积，缓慢
2、加入转移液体积1/3体积的无水乙醇（如：300 l的转移液加100 l无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2 min, 室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。7. 量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇（如：300 l的流出液加200 l无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2 min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelu
3、te。8. 向吸附柱miRelute中加入500 l去蛋白液MRD(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2 min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，弃废液。9. 向吸附柱miRelute中加入600 l漂洗液RW（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，弃废液。10. 重复操作步骤9。11. 将吸附柱miRelute放入2 ml收集管中，室温 12,000 rpm (13,400g)离心1 min，去除残余液体。注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱miRelute在室温放置
4、片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。产品内容产品组成DP501(50 preps)裂解液MZ（Buffer MZ） 60 ml漂洗液R W（Buffer RW） 15 ml去蛋白液MRD（Buffer MRD） 12 mlRNase-Free ddH2O 15 ml吸附柱miRspin （RNase-Free Spin Columns miRspin） 50个吸附柱miRelute （RNase-Free Spin Columns miRelute） 50个RNase-Free离心管（1.5 ml）（RNase-Free Centri
5、fuge Tubes 1.5 ml） 50个RNase-Free收集管（2 ml）（RNase-Free Collection Tubes 2 ml） 250个储存条件裂解液MZ 应在2-8 避光保存，其他溶液和吸附柱室温(15-25)保存。1 6Order: 010-59822688Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。12. 将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5 ml离心管中，加15-30 l R
6、Nase-Free ddH2O，室温放置2 min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心2 min。注意：洗脱缓冲液体积不应少于15 l，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70，以防降解。如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次；或者增加血清或血浆的样品量并成比例增加裂解液和氯仿的用量。TIANGEN为您提供国际化标准的生物学产品和服务： PCR、RT-PCR系列 核酸DNA、RNA分离纯化系列 DNA分子量标准 克隆载体、感受态细胞 细胞生物学产品 蛋白分子量标准 蛋白质染色、检测及定量相关产品版本号: DP121221miRcute miRNA Isolation Ki
7、tmiRcute miRNA提取分离试剂盒(离心柱型)目录号：DP501二、组织或细胞中T otal RNA的提取（提取的total RNA中含有miRNA等small RNA）。对miRNA的纯度要求不高时，比如在研究miRNA RT-PCR、miRNA Northern blot时也可以采用此方法。1. 样品处理(同一、组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-1)2. 同一、组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-23. 同一、组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-34. 同一、组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-45. 同一、组织或细胞中miRNA富集部分的提取步骤-56.
8、 量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1.5倍的无水乙醇(如：500 l的转移液加750 l无水乙醇)，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin中，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱m iRspin，请分两次转入，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRspin。7. 向吸附柱miRspin中加入500 l去蛋白液MRD(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2 min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，弃废液。8. 向吸附柱miRspin中加入600 l漂洗液RW(请先检
9、查是否已加入乙醇)，室温静置2 min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，弃废液。9. 重复操作步骤8。10. 将吸附柱miRspin放入2 ml收集管中，室温 12,000 rpm (13,400g)离心1 min，去除残余液体。注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱miRspin在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。11. 将吸附柱miRspin转入一个新的RNase-Free 1.5 ml离心管中，加30-100 l RNase-Free ddH2O，室温放置2 min
10、，室温 12,000 rpm (13,400g)离心2 min。洗脱缓冲液体积不应少于30 l，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70，以防降解。注意：如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次。产品简介miRNA提取试剂盒是专门针对miRNA提取而开发的新一代产品，同时还可以提取small interfering RNA(siRNA), small nuclear RNA (snRNA)等small RNA，也可以用于Total RNA的提取。该试剂盒中的裂解液是经过长时间研发改良的，具有一般裂解液不具有的裂解能力和提取灵敏度，试剂盒中的吸附柱采用特殊的硅基质膜填料，大大增强了其对RNA
11、的吸附能力，尤其是small RNA(200 nt)。得到的RNA纯度更好，质量更高。该试剂盒适用于各种样本（细胞，动物组织，植物组织，血清，血浆）中RNA的提取，每个吸附柱每次可处理3050 mg动物组织(RNA含量高的组织,如肝脏不能超过30 mg)，100 mg植物组织或1107细胞。1 h内即可完成所有操作，提取的RNA没有DNA和蛋白污染，可用于Northern Blot、Dot Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆。注意事项预防RNase污染，应注意以下几方面1 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2 使用无RNase的塑料
12、制品和枪头避免交叉污染。3 RNA在裂解液中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4 h，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4 配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，放置过夜，高压灭菌。）5 2操作步骤第一次使用前应在漂洗液R W和去蛋白液MRD中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。一、组织或细胞中miRNA富集部分的提取。对miRNA的纯度要求较高时，比如在研究miRNA芯片、miRNA克隆时建议采用
13、此方法。1. 样品处理a. 组织：将组织在液氮中磨碎。 每3050 mg动物组织或者100 mg植物组织加1 ml 裂解液MZ，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液MZ体积的十分之一。b. 单层培养细胞：直接在培养板中加入裂解液MZ裂解细胞，每10 cm2面积加1 ml MZ。用取样器抽打几次。注意：裂解液MZ的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。c. 细胞悬液：离心2,100 rpm（400g）5 min取细胞，弃上清。加入1 ml 裂解液MZ，振荡器振荡或移液器吸打数次混匀。加裂解液MZ前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。2.
14、 将匀浆样品在室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。3. 可选步骤： 4 12,000 rpm (13,400g) 离心5 min，取上清，转入一个新的RNase-Free的离心管中。注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可加此步骤离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。4. 加入200 l氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置5 min 。5. 4 12,000 rpm (13,400g) 离心15 min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液M
15、Z试剂的50%。把水相转移到新管中，进行下一步操作。6. 量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇(如：500 l的转移液加215 l无水乙醇)， 混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin中，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，若一次不能将全部溶液和沉淀加入吸附柱miRspin中，请分两次转入，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。7. 量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积0.75倍的无水乙醇（如：700 l的流出液加525 l无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelu
16、te中，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱miRelute中，请分两次转入，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。8. 向吸附柱miRelute中加入500 l去蛋白液MRD（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，弃废液。9. 向吸附柱miRelute中加入600 l漂洗液RW（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30 sec，弃废液。10. 重复操作步骤9。11. 将吸附柱miRelut
17、e放入2 ml收集管中，室温 12,000 rpm (13,400g)离心1 min，去除残余液体。注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱miRelute在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。12. 将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5 ml离心管中，加15-30 l RNase-Free ddH2O，室温放置2 min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心2 min。注意：洗脱缓冲液体积不应少于15 l，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70，以防降解。注意：如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次。3 4
