1、血型鉴定与交叉合血,王炼红 解读,血型的定义及分类,血型是指各种血液成分的遗传多态性标记。血型抗原不仅存在于红细胞上,也存在于白细胞和血小板上，还存在于各种组织细胞、多数体液中，甚至不同个体的血清蛋白间也存在型别的差异。血型系统主要分类：1.红细胞血型系统，其中又分为ABO血型系统、Rh血型系统、MNS血型系统、P血型系统、Kell血型系统、Kidd血型系统、Duffy血型系统2.人类主要组织相容性抗原系统（HLA)3.血小板血型系统（PHA）4.血清型。血清型按蛋白质可分为免疫球蛋白、血清酶、血清蛋白、补体等几大类。,血型鉴定,血型鉴定主要用已知特异性的抗体鉴定未知的红细胞抗原，或辅助用已知
2、抗原的一组红细胞（谱红细胞）鉴定未知血清的抗体，结合相关理论基础综合判断血型。血型鉴定以抗原、抗体免疫检测技术为基础，常用的方法有盐水介质法、微柱凝胶卡片法、聚凝胺法，疑难血型还可用聚合酶链反应（PCR）技术直接分析相关血型的基因。,1.1 ABO血型鉴定实验原理： 根据红细胞上有或无A抗原或B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型4种。利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。所谓正定型，是用已知抗-A和抗-B分型血清来测定红细胞上有无相应A抗原或/和B抗原；所谓反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗-A或/和抗-B。,试剂和材料 ：1) 抗-A(B型血)、抗-
3、B(A型血)及抗-A+B(O型血）分型血清，购置商品试剂。 2) 5A、B及O型试剂红细胞盐水悬液。3) 受检者血清。 4) 受检者5红细胞盐水悬液。,ABO血型鉴定的检测方法,1.试管法 （1）取洁净小试管（内径10mm60mm)3支，分别标明抗-A、抗-B 、抗-A+B,用滴管分别加抗-A、抗-B 、抗-A+B分型血清各1滴于试管底部，再以滴管分别加入受检者5红细胞盐水悬液1滴，混和。（ 2）另取洁净小试管（内径10mm60mm)3支，分别标明A、B、O细胞,用滴管分别加入受检者血清1滴于试管底部，再以滴管分别加入5 A、B、O试剂红细胞盐水悬液1滴，混和。（3) 立即以1000rmin离
4、心lmin.（4）将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以内眼观察有无凝集(或溶血)现象。如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。（5) 观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B或cisAB的发现。,4 红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。 3 红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。2 红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细 胞。1 肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞 土 镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞 MF 混合凝集外观(mixed field)是指镜下可见少 数红细胞凝集，而极大多数红细胞仍呈分散分布。 一 表示阴性，镜下未见凝集
5、，红细胞均匀分布。,5) 凝集强度判断标准,2.玻片法 （1) 取清洁玻片1张(或白瓷板1块)，用蜡笔划成方格，标明抗-A、抗-B、抗A+B,分别用滴管滴加抗-A、抗-B、抗-A+B分型血清1滴于标明的方格内，再各加受检者2红细胞悬液1滴，混和。 （ 2) 另取洁净玻片一张(或白瓷板1块)，用蜡笔划成方格，标明A细胞、B细胞和O细胞，用滴管各加受检者血清1滴，再分别用滴管滴加A、B和O型试剂红细胞悬液1滴。（ 3) 将玻片(或白瓷板)不断轻轻转动，使血清与红细胞充分混匀，连续约15min，以肉眼观察有无凝集(或溶血)反应。玻片作试验时，也应用低倍镜观察结果。,4）结果判定 ABO血型正反定型结
6、果 注释：十为凝集；一为不凝集。分型血清+受检者RBC 受检者血型 受检者血清+试剂RBC 抗-A 抗-B 抗-A十B A细胞 B细胞 O细胞十 十 A 十 十 十 B 十 一 O 十 十 十 十 十 AB ,5）注意事项 （1）分型血清质量性能要符合要求，用毕后应放置冰箱保存，以免细菌污染。 （2） 试剂红细胞以3个健康者同型新鲜红细胞混和，用生理盐水洗涤3次，以去除存在于红细胞表面的血清中成分及可溶性抗原。 （3）试管、滴管和玻片必须清洁干燥，防止溶血。 （4） 操作方法应按规定，一般应先加血清，然后再加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。,（5) 按理IgM抗-A和抗-B与相应红细胞的
7、反应温度以4为最强，但为了防止冷凝集现象的干扰，一般仍在室温(20-24)内进行试验，37可使反应减弱。 （6) 离心时间不宜过长或过短，速度不宜过快或过慢，以防假阳性或假阴性结果。（7) 观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别。 （8) 判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。,正反定型结果不一致的原因主要有以下三个方面：一、技术性方面问题二、红细胞方面的问题三、血清方面的问题,常见情况如下：1) 分型血清效价太低、亲和力不强。若抗-A血清效价不高，可将A亚型误定为O型，AB型误定为B型。 2) 红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，误判为阴性反应。
8、3) 受检者红细胞上抗原位点过少(如亚型、新生儿)或抗原性减弱(见于白血病或恶性肿瘤）以及类B或cisAB等。 4) 受检者血清中蛋白紊乱(高球蛋白血症、高浓度的纤维蛋白原)，或实验时温度过高，常引起红细胞呈缗钱状排列。,5) 受检者血清中缺乏应有的抗-A或抗-B抗体，如丙种球蛋白缺乏症。6) 各种原因引起的红细胞溶解，误判为不凝集。部分溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体. 7) 由细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集，往往是正反定型不符的原因。 8) 血清中有意外抗体，如自身抗-I，常引起干扰。9) 老年人血清中抗体水平大幅度下降。,正反定型结果不一致的解决办法如发现ABO正反定型结果不
9、一致，先要重复做试验1次。严格执行操作规程，使用质量合格的试剂以及细心观察和解释试验结果，就可解决明显的问题，对一些疑难问题必须进一步按以下步骤进行研究。,检查步骤 ：1) 另从受检者采取l份新鲜血液标本，这样可以纠正因污染或搞错样本造成的不符合。 2) 将红细胞洗涤数次，配成5盐水细胞悬液，用抗-A、抗-B、抗-AB、抗-A1及抗H做试验可以得到其它有用的信息。 3) 对受检红细胞作直接抗球蛋白试验,如结果呈阳性,表示红细胞已被抗体致敏。 4) 用A1、A2、B、O红细胞及自身红细胞检查受检血清。如果怀疑是抗-I，用O型(或ABO相合的)脐血红细胞检查。,5)如果试验结果未见凝集，应将试验至
10、少在室温和4放置30min，用显微镜检查核实。 6) 若疑为A抗原或B抗原减弱，将受检红细胞与抗-A或抗-B血清作吸收及放散试验以及受检者唾液作A、B、H血型物质测定。后者只对80%HAB分泌型的人有用。7) 若试验结果红细胞呈缗钱状排列，加等渗盐水l滴，混和，往往可使缗钱现象消失。应注意，不要先加盐水l滴于受检者血清中而后和红细胞作试验，以免使血清中抗体被稀释。,8）若受检者为A型血而疑为有类B抗原时，可用下列方法进行鉴别 ：（1）观察细胞与抗-A及抗-B的凝集强度，与抗-A的反应要比与抗-B的反应强。这种区别用玻片法作试验更为明显。（2）用受检者红细胞与自身血清作试验，血清中的抗-B不凝集
11、自身红细胞上的类B抗原。（3）检查唾液中是否有A、B物质，如果是分泌型，可检出A物质而无B物质。 （4）核对患者的诊断，类B抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关。,9) 如发现多凝集现象，应考虑由遗传产生的Cad抗原活性；被细菌酶激活的T或TK受体；或产生机制不太明了的Tn受体所引起。 多凝集红细胞具有以下特点： 能被人和许多家兔的血清凝集，不管有无相应的同种抗体。 不被脐带血清凝集。 通常不与自身的血清凝集。,原理： 用5种抗Rh分型血清抗-C、抗-c、抗-D、抗-E、抗-e 来检测红细胞抗原.在Rh血型系统中D抗原的抗原性最强，出现的频率最高,临床上影响最大，故临床上一般只鉴定
12、D抗原。常用抗-D 血清来测定红细胞,凡带有D抗原者，称为Rh阳性，不带有D抗原者，称为Rh阴性。 试剂：抗D血清(购买商品试剂)。 操作： 试管法：取RhD(IgM)试剂50uL和5%受检者红细胞盐水悬液50uL，加入小试管内，摇匀，900g离心15秒，判定结果。同时做阴阳性对照。凝集(或溶血)反应为Rh阳性, 无凝集(或溶血)反应，仅表明实验的红细胞缺少正常强度的D抗原，再用不同批号抗D血清做重复试验，如无凝集(或溶血)反应，不能轻率地报告Rh阴性，应做Du鉴定。,1.2 Rh血型鉴定,注意事项：（1）Du 型人经输注D阳性红细胞后可产生抗D抗体，所以患者为Du 型应作Rh阴性论，应输注R
13、h阴性血液;供血者为Du 型，应作Rh阳性论，不应当输给Rh阴性患者。（2）Du 型妇女与Rh阳性丈夫生育的婴儿可以产生新生儿溶血病。（3）本实验不适合于自身凝集的样本的检查，因自身凝集的样本容易引起假阳性。（4）对于检测为弱阳性和阴性的样本，应采用抗人球蛋白实验检测弱D抗原或不完全D抗原是否存在，同时做进一步的确认实验。,交叉配血试验 交叉配血试验又称不配合性试验，是确保患者安全输血必不可少的试验，完整操作规程应包括：1.查阅受血者以前的血型检查记录（包括Rh血型)；2.对收到的受血者样本做ABO正反定型和Rh定型；3.选择合格的血液作交叉配血试验。,交叉配血的方法：（1）盐水介质配血法（2
14、）酶介质配血法（3）抗人球蛋白配血法（4）凝聚胺介质配血法（5）微柱凝胶卡配血法,1.盐水介质配血法 标本处理 : 1) 抽取受血者静脉血3-4ml, 待凝固后分离血清，并将红细胞配成2%盐水悬液。2) 将供血者血样以同样方法分离血清，并将红细胞配成2%盐水悬液。,操作1)取洁净小试管两支，1支标明主侧（受血者血清供血者红细胞）；另1支标明次侧（供血者血清受血者红细胞）。 2)按标记主侧管加受血者血清1滴，加供血者红细胞悬液1滴。次侧管加供血者血清1滴，加受血者红细胞悬液1滴，混匀，以1000r/min离心1min，轻轻侧动试管，观察结果。室温较低时，应将试管保温，以防冷凝集素引起的凝集反应。
15、,结果判断及报告：1) ABO同型配血,主侧和次侧均无溶血及凝集表示无输血禁忌，可以输血。2) 两人值班时，交叉配血试验由两人互相核对；一人值班时，操作完毕后自已复核，并填写配血试验结果。,注意事项：1）受血者配血试验的血标本必须是输血前3天之内的。 2) 血库要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO血型（正、反定型），并常规检查患者Rh（D）血型（急诊抢救患者紧急输血时Rh(D)检查可除外），正确无误时才可进行交叉配血。 3) 凡输注全血、浓缩红细胞、红细胞悬液、洗涤红细胞、冰冻红细胞、浓缩白细胞、手工分离浓缩血小板等患者，应进行交叉配血试验。机器单采浓缩血小板应A
16、BO血型同型输注。 4) 凡遇有下列情况必须按全国临床检验操作规程有关规定作抗体筛选试验：交叉配血不合时；对有输血史、妊娠史或短期内需要接收多次输血者。,2 改良离子交叉配血试验,原理 红细胞表面带有大量的负电荷，当红细胞悬浮在电解质溶液中时，阳离子会被红细胞的负电荷所吸引，此时红细胞则被扩散的双层离子云所围绕而形成Zeta电位，Zeta电位决定红细胞之间的相互排斥作用。凝聚胺技术首先利用低离子溶液降低介质的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，以促进红细胞和血清（血浆）中的抗体结合。其后再加入凝聚胺溶液，它是一种高价阳离子多聚物，肝素中和剂，溶解后能产生很多正电荷，中和红细胞表面带有的负电荷，
17、使红细胞Zeta电位降低，缩短红细胞之间的距离，使红细胞产生非特异性的凝聚。最后加入悬浮液，具有中和凝聚胺阳离子的作用，使正常的红细胞非特异性凝集散开，实验结果为阴性；但如果红细胞已被相应的抗体致敏，凝集就不会散开，实验结果为阳性。,试剂组成: R1 低离子介质溶液（LIM），主要 成份（0.2%EDTA-Na2 ，5%葡萄糖）R2 凝聚胺溶液（Polybrene），主要成份（0.05%Polybrene ，0.9 %氯化钠）R3 悬浮液（Resuspending) ，主要成份（3.5%柠檬酸三钠，1.5%葡萄糖）R4 阳性对照血清（含抗D血清，氯化钠及稳定剂)R5 抗人IgG血清,试验步骤：
18、1) 取试管二支，标主次侧，主侧管加病人血清（血浆）2滴，加供血者3%-5%红细胞悬液1滴，次管反之。 2) 各加LIM0.65mL，混合均匀后，再各加Polybrene溶液2滴，混合均匀。3）用离心机3400转/min离心10秒，然后把上清液倒掉，让管底残留约0.1mL的液体。4) 轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，若无凝集，实验无效，必须重做。5）最后加入悬浮液2滴，轻轻摇动试管混合并同时观察结果。如果凝集在60秒内散开，则是由Polybrene引起的非特异性聚集，配合结果相合，如凝集不散开，则为红细胞抗原与抗体结合的特异性反应，配合结果不相合。观察凝集与否都需在显微镜下确认。,3 直接抗
19、人球蛋白试验试剂和材料 1.抗人球蛋白血清。 2.用不完全抗D致敏的5%Rh（D)阳性O型红细胞盐水悬液做阳性对照用：取3人型红细胞混合，经盐水洗涤后取压积红细胞，加等量抗D血清，置370水浴致敏1小时，取出后离心去处上清液，再用红细胞保存液配成5%红细胞悬液。 3.正常人5%RH（D）阳性红细胞盐水悬液（未致敏），做阴性对照用，除不用抗致敏外，按上法配制。,操作 ：1.取受检者红细胞，以生理盐水洗涤3次，末次洗涤后，将上层盐水倒尽，再以滤纸将管口附着的盐水吸去，配成盐水配成5%红细胞悬液。 2.取上述5%红细胞悬液1滴，滴入小试管内，加抗球蛋白血清1滴，混匀。 3.阳性对照：不完全抗D致敏的
20、5%红细胞盐水悬液1滴，加抗球蛋白血清1滴，混匀。 4.阴性对照：正常人5%D阳性红细胞悬液一滴加抗球蛋白血清一滴,混匀。 5.受检管以及阳性、阴性对照管同时以1000rmin离心1分钟，轻轻混合，观察结果。 6.结果判定：如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检者红细胞凝集者直接抗球蛋白为阳性，不凝集者为阴性。,注意事项：1.受检红细胞一定用盐水洗涤3遍，每次彻底弃去盐水，除去血清蛋白，以防假阴性。2.如需了解在体內致敏红细胞的Ig类型，则可分别以抗IgG、抗IgM、抗C3单价抗球蛋白血清进行实验。 3.用盐水作对照，在显微镜下观察结果，凡有34个以上红细胞的凝集，均匀分布在红细胞之间者为阳
21、性；无凝集者为阴性。患儿红细胞加盐水管应不凝集，如凝集说明有自凝现象,4 微柱凝胶卡配血法,原理：凝胶具有分子筛效应，在微柱凝胶介质中红细胞抗原与相应抗体结合，经过离心后，结合抗体的红细胞悬浮在凝胶上层，而未与抗体结合的红细胞则沉于凝胶底部（管底尖部）。试剂：用交叉配血凝胶微柱卡（商品试剂盒）。操作：（1）标记，在凝胶微柱卡上做好主、次测标记。（2）加样，按说明书要求主侧管加入0.5-0.8%献血者红细胞和受血者血清各50ul，次侧管反之。（3）孵育，37C专用箱孵育15分钟。（4）离心，用专用离心机离心。（5）判定结果，红细胞浮在凝胶表面，分散于凝胶中或出现溶血现象为阳性反应，说明存在相应抗
22、原抗体。红细胞沉于凝胶底部为阴性，表示不存在对应的抗原抗体。,四种方法的优缺点：（1）盐水配血法：简便快速。主要缺点是只能检出不相配合的完全抗体，而不能检出不完全抗体。 （2）抗人球蛋白法配血法：又称Coombs试验。是最可靠的确定不完全抗体的方法，但操作繁琐。抗球蛋白法配血法是最早用于检查不完全抗体的方法。直接抗球蛋白法可检查受检者红细胞是否已被不完全抗体致敏；间接抗球蛋白法可用于鉴定Rh血型及血清中是否存在不完全抗体。本法虽较灵敏，但也有一定限度，且操作复杂，不利于急诊检查和血库的大批量工作。 （3）聚凝胺配血法：可以检出IgM与IgG两种性质的抗体，能发现可引起溶血性输血反应的几乎所有规
23、则与不规则抗体，故本法已逐渐推广使用。（4）凝胶配血卡片法：又称微管（板）凝胶抗球蛋白试验，此法在凝胶中进行，保持了传统抗球蛋白试验的准确，具有简便、可靠的特点，但成本较高。,新生儿溶血病,新生儿溶血病又称母子血型不合溶血病，是母亲对胎儿红细胞发生同种免疫反应引起的溶血性疾病，是新生儿病理性黄疸最常见的原因，在中国以ABO血型不合溶血病发生率最高，Rh血型不合溶血病发生较少，但Rh溶血临床表现比 ABO血型不合溶血病重。MN溶血最为罕见。,发病机理（一）,新生儿溶血病是由于母体存在与胎儿血型不相容的血型抗体(1gG)引起。因胎儿红细胞进入母体循环，当母体缺乏胎儿红细胞所具有的抗原时，母体就产生
24、相应的血型抗体，此抗体通过胎盘进入胎儿循环，则引起胎儿红细胞凝集、破坏。 ABO血型不合引起的溶血，多发生于O型产妇所生的A型或B型血的婴儿。因为O型血孕妇中的抗A、抗B IgG抗体，可通过胎盘屏障进入胎儿血循坏。理论上讲母A型血，胎儿B型或AB型血，或母B型血，胎儿A型或AB型血也可发病，但临床少见。主要是因为A型或B型血的产妇，其抗A 、抗B抗体主要为IgM，不易通过胎盘屏障进入胎儿血循环。,发病机理（二）,O型血妇女，由于A，B抗原因子在自然界广泛存在，在孕前可能受某些血型物质的刺激，如寄生虫、感染、注射疫苗及进食某些含有A，B抗原的植物等，使机体产生抗A、抗B的IgG，妊娠期间这些抗体
25、可通过胎盘进入胎儿体内而引起溶血。故本病约一半可发生在第一胎。Rh血型不合引起的溶血，在Rh血型系统中有6种抗原(C，c；D，d；E，e)。其中以D抗原的抗原性最强。E，e，C，c次之，d目前尚未发现。中国国内多见于少数民族，因为少数民族妇女中Rh阴性较多。当Rh阴性妇女所怀胎儿为Rh阳性时，其D抗原通过胎盘进入母体血循环，刺激母体产生抗D抗体，当孕妇怀第二胎时，此抗体通过胎盘进入胎儿，而发生抗原抗体反应，使胎儿红细胞发生凝集、破坏，出现溶血。,新生儿溶血病的实验室检查,产前对孕妇进行监测：通过检测夫妻血型，预测胎儿的血型以及母婴之间是否可能存在血型不合，进而检测母亲体内是否存在IgG类抗体及
26、效价测定，预测胎儿是否可能患ABO或Rh新生儿溶血病。从而做到早发现，早诊断，早治疗，甚至提前阻止新生儿溶血病的发生。产后对新生儿进行检测 ：即新生儿三项试验，直接抗人球蛋白试验 、游离试验 、放散试验,自身免疫性溶血性贫血,自身免疫性溶血性贫血（Autoimmune hemolytic anemia，AIHA）系体内免疫功能调节紊乱，产生自身抗体和（或）补体吸附于红细胞表面，通过抗原抗体反应加速红细胞破坏而引起的一种溶血性贫血。自身免疫性溶血性贫血根据抗体作用于红细胞膜所需的最适温度分为温抗体型和冷抗体型,自身免疫性溶血性贫血,温抗体型：37时作用最活跃，不凝集红细胞，为IgG型不完全抗体。
27、冷抗体型：20以下作用活跃，低温下可直接凝集红细胞，为完全抗体，绝大多数为IgM。还有一种特殊的IgG型冷抗体即D-L抗体（Donath-Landsteiner antibody）：在20以下时可结合于红细胞表面，固定补体，当温度升高至37时，已结合在红细胞上的补体被依次激活，导致红细胞破坏而引发“阵发性寒冷性血红蛋白尿”（paroxysmal cold hemoglobinuria, PCH）。温抗体型AIHA的靶抗原以Rh抗原最多见，冷抗体型的抗原多为Ii抗原，PCH时以P抗原为主。,自身免疫性溶血性贫血检查,1）血象：血红蛋白和红细胞计数与溶血程度相关，周围血片可见球形红细胞、幼稚红细胞
28、，红细胞碎片，网织红细胞增多。 2）骨髓象：呈幼红细胞增生，偶见红细胞系统轻度巨幼样变，这与溶血时维生素B12和叶酸相对缺乏有关。 3）有关溶血的检查：血清胆红素升高，以间接胆红素为主；新鲜尿检查可见尿胆原增高；血清结合珠蛋白减少或消失；可有血红蛋白尿和Rous试验阳性。,自身免疫性溶血性贫血检查,4）抗人球蛋白（Coombs）试验：分为直接抗人球蛋白试验（DAT，检测红细胞上的不完全抗体）和间接抗人球蛋白试验（IAT，检测血清中的游离抗体），温抗体型DAT阳性，部分患者IAT也阳性。当抗体数低于试验阈值时，DAT可呈阴性。DAT的强度与溶血的严重程度无关，有时本试验虽呈弱阳性，但发生了严重溶血；反之，有时本试验呈强阳性，而无明显溶血的表现。 5）冷凝集素试验：冷凝集素综合征时效价增高。 6）冷溶血试验：又称Donath-Landsteiner（D-L）试验。D-L 型自身抗体属于IgG型免疫球蛋白，在补体的参与下，可通过4与37两期溶血试验加以检测。阵发性寒冷性血红蛋白尿患者该试验阳性。,很高兴和大家一块共同学习谢谢各位祝：工作顺利！生活愉快！,
