1、ABO、Rh血型鉴定 与交叉配血试验技术,华中科技大学同济医学院检验系 曹奎杰,教学内容,重点掌握 ABO血型正反鉴定原理、方法学评价及正反鉴定不一的原因 Rh血型鉴定常用的方法、方法学评价及临床意义 交叉配血试验技术原理、及各种交叉介质的优缺点,一 红细胞ABO血型鉴定,试管法红细胞ABO血型鉴定平板法红细胞ABO血型鉴定,ABO血型鉴定的原理,利用RBC凝集实验，可准确鉴定RBC表面是否存在A抗原或者B抗原（正向定型即细胞定型），以及血清中有无抗-A或抗-B（反向定型即血清定型），通过正反定型可将人类血型分为、型四种。,正向定型（forward typing）/细胞定型（cell grou
2、ping ）：用已知血型特异性的抗体试剂鉴定RBC的抗原反向定型（reverse typing）/血清定型（serology grouping ）：同时用已知血型的试剂RBC鉴定血清中的抗体正反定型正常情况应相符,正向定型,反向定型,ABO血型鉴定的方法,盐水介质法（试管法、平板法） 微柱凝胶法 微量板法（U型、V型） 分子生物技术,试管法红细胞ABO血型鉴定,样本,抗凝或不抗凝待检血液（血清与RBC已分离或分层好）,可选试管,试剂,单克隆或多克隆的抗-A试剂；单克隆或多克隆的抗-B试剂；抗-A,B（供选择）要求：1、高度特异性 2、抗A、抗B效价均不低于1:1283、高亲和力 4、冷凝集素效
3、价1:4以下5、无任何污染 2%5%的A型、B型和O型RBC盐水悬液,试剂血清,红细胞悬液的配置,实验操作步骤,正向定型,反向定型,实验结果凝集判断（肉眼）,实验结果凝集判断（镜下）,结果判断,注：阴性结果应在显微镜下进一步观察，以免漏检,平板法红细胞ABO血型鉴定,玻片 纸板 陶瓷板 搪瓷板,实验操作步骤,加试剂血清 一滴 加RBC悬液一滴轻摇平板2min 判断结果,结果判断,纸板法检测血型,结果判断,有可疑结果应用试管法重新实验不要混淆干燥的边缘与凝集,全自动微板法,检测技术产生于全自动血液样品系统+凝集实验的扫描酶标仪问世 通过标准化加样、孵育、离心、悬浮、静止、以及反应前后吸光度值增加
4、数值的计算，从而达到对血型进行正、反定型 应用ABO 血型自动化检测方法进行正反定型试验,一次判读正确率在99. 8 %以上,且能提高检测灵敏度,使弱凝集样本更易显现,全自动微板法,改变了传统的手工操作、肉眼判读结果的检测方法 具有快速、准确、自动化程度高等优点,适合批量操作 血型微量化检测具有节约大量昂贵抗血清、缩短检测时间、操作程序简单等优点, 目前在各大采供血机构已得到广泛应用 但是亦有将B3亚型伴抗-B 误判为O 型的个案报道,说明ABO 血型自动化检测系统设计对特殊的ABO 亚型正反不一的判读有待进一步完善,ABO血型鉴定方法学评价,平板法优点：操作简单，实用于大量标本不足：反应时间
5、长，易污染不适合检查血清中抗体（患者血清抗体效价低，不易引起RBC凝集）不能准确进行ABO血清定型 试管法 快速，借助离心力促进RBC凝 集，适用于急诊检查,ABO血型试验正、反定型不一的原因,技术问题 血清因素 红细胞因素 其他因素,ABO血型试验正、反定型不一的原因 技术原因,离心过度或不足 细胞与血清反应比例不适当 阳性反应产生溶血现象未能识别（怎样区别），导致假阴性结果 试剂污染或失效 器材不清洁等,ABO血型试验正、反定型不一的原因 血清因素,异常的血浆蛋白：血浆白、球蛋白比例异常，高浓度的纤维蛋白原等，能导致缗钱状RBC形成，造成假凝集现象 低丙种球蛋白，抗体减弱 待检血清有不规则
6、抗体存在，与试剂A、B细胞上的抗原起反应,ABO血型试验正、反定型不一的原因 血清因素,患者输入了高分子的血浆代替品或注射造影剂等 近期大量非同型血浆置换 血清抗体效价太低，亲和力不强：如新生儿（新生儿不宜反定型） 、老年人,ABO血型试验正、反定型不一的原因 RBC因素,RBC致敏状态：受免疫球蛋白致敏 疾病使RBC上抗原减弱或抗原位点减弱：白血病，难治性贫血，恶性肿瘤 获得性B：革兰氏阴性菌感染，RBC可获得“类B”的活性 异常基因型：ABO亚型，A、B抗原可能为弱抗原，难以检出,ABO血型试验正、反定型不一的原因 RBC因素,近期输血：异型输血，混合外观凝集 嵌合体血型（开米粒，chim
7、erism）：有两类血型RBC群， 混合外观凝集 RBC多凝集现象：RBC因遗传或获得性的表面异常，出现多凝集现象 血型物质过高可干扰（中和）抗-A和抗-B定型试剂：卵巢囊肿,ABO血型试验正、反定型不一的原因 其他因素,药物：左旋糖苷、造影剂等 年龄：婴儿、老年人 防腐剂,正反定型不一的处理原则,重复试验，如果先前试验中红细胞悬浮在血清或血浆中，则改为用洗涤后的红细胞并悬浮在盐水中，进行重复试验 如果重复试验仍是正反定型不符，则须进一步进行研究,正反定型不一的处理方法,重抽标本，纠正标本污染或标记错误而造成的错误结果 查询患者既往史、输血史、骨髓移植史和用药史等 多次洗涤标本RBC或试剂RB
8、C，除去可能引起意外阳性反应的血浆中的或试剂RBC保存液中的化学成分；换用新开封的无菌生理盐水洗涤红细胞 应用抗-A,B、抗-A1或抗H检测RBC,正反定型不一的处理方法,如果怀疑血清中有抗- A1，则用数份A1或A2 RBC标本进行检验 分析O型筛选细胞检测结果，确定是否是同种异型或自身冷抗体干扰正反定型结果 室温孵育30min后，离心观察凝集结果，能检测弱的抗原抗体反应，但要用O型和自身RBC做对照，以排除抗-I或抗H等抗体的干扰。抗-I或抗H是对所有成人RBC都反应的凝集素,正反定型不一的处理方法,如果试验结果未见凝集，应将RBC及血清试验在室温（1822）或4放置30min，用显微镜检
9、查核实 如疑为抗原或抗原减弱，则可将受检RBC与抗或抗血清做吸收及放散试验，以及检测受检者唾液、血型物质 缗钱状RBC，用生理盐水洗涤RBC，可使缗钱状消失,正反定型不一的处理方法,如受检者可能存在类抗原时，可用下列方法进行鉴别： 观察细胞与抗及抗的凝集强度，与抗的反应要比与抗的反应强，这种区别用玻片法试验更为明显 用受检者RBC与自身血清做试验，血清中的抗不凝集自身RBC上的类抗原 检查唾液中是否有、物质，如果是分泌型，可检出物质而无物质 核对病人的诊断，类抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰氏阴性细菌感染有关 酸化检测抗体血清检测试剂,正反定型不一的处理,多凝集现象：红细胞因遗传或获得性的表面
10、异常；多为被细菌酶激活的或TK受体或产生机制不大明了的Tn受体所引起。 多凝集RBC具有以下特点：,多凝集现象特点,能被人和家兔的多种血清凝集 能与大多数成年人血清凝集，不管有无相应的同种抗体 不被脐带血清凝集 通常不与自身血清凝集 如有条件可用外源凝集素加以鉴别,二 Rh血型鉴定,Rh血型检查在临床上的重要性，仅次于ABO系统。Rh血型不合的输血有可能危及病人的生命 母子Rh血型不合的妊娠，有可能发生死胎、早产、新生儿溶血症 Rh血型在我国99以上是RhD阳性，白种人RhD阴性约占15，黑种人约占4,Rh血型鉴定,原理 方法 RhD阴性的确诊实验,Rh血型鉴定的原理,Rh血型系统，主要有5种
11、抗血清，即抗、抗c、抗、抗、抗 用5种抗Rh定型血清，来检查RBC抗原，可有18种表现型,Rh血型鉴定的原理,在临床输血中，一般只做抗原的鉴定，凡被检RBC与抗-血清凝集者为RhD阳性，不凝集者为RhD阴性 其他Rh抗原鉴定和抗原一样只是加相应的抗血清即可,Rh分型,Rh血型鉴定的方法,（以RhD鉴定为例） 单克隆混合试剂检测法：用RhD定型混合试剂，即单克隆抗体lgM+lgG型对RBC上D抗原进行鉴定,Rh血型鉴定的方法,若选用lgG型RhD定型试剂，方法如下： 低离子强度盐水实验 当降低离子强度时，可减少RBC外围的离子云，促进IgG分子在两个RBC之间搭桥 酶介质法 破坏RBC表面的唾液
12、酸；改变RBC表面结构，使隐蔽抗原暴露 抗人球蛋白法 (直接法、间接法）通过抗球蛋白在致敏RBC间建立一种桥梁关系 聚凝胺法 聚凝胺是高价阳离子的多聚季胺盐，溶解后产生很多正电荷，中和RBC表面的负电荷，减少它们之间的排斥力，缩小距离，有利于RBC凝集,试剂,抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e合适 的试剂，包括多克隆的高蛋白试剂或低蛋白试剂、单克隆试剂等。 已知Rh五个抗原阳性和阴性的对照红细胞,操作步骤,结果判断,结果判断,在作RhD抗原鉴定时,如受检者RBC与盐水反应性抗-D试剂不发生凝集时，则需进一步加做RhD阴性确认实验,Rh阴性的确认实验,三种不同批号的IgG性质抗-D血清与受检
13、者25%RBC悬液反应 方法：低离子强度盐水实验 酶介质法 抗人球蛋白法（参考方法）聚凝胺法,RhD酶介质法,混匀，37水浴30min，900g离心1min； 轻轻摇动试管，观察管底RBC凝集情况。,Rh阴性的确诊实验,结果判断确诊实验（） RhD（）确诊实验（+） Du型（弱D） Du型（弱D）作为 受血者：归RHD（）Du型（弱D）作为献血者：归RHD（+）,Rh阴性的确诊实验吸收放散实验基因分型技术鉴定,Rh血型鉴定的方法学评价,Rh血型系统的抗体多由后天免疫刺激（输血或妊娠）产生，故一般不需做反定型实验 Rh定型主要鉴定D抗原，定型时应按抗-D血清试剂的使用说明进行，并注意必须要有严格
14、的对照试验，包括抗原的阴、阳性对照以及试剂对照试验,Rh血型鉴定的方法学评价,产生假阳性的原因 受检细胞已被致敏，或标本血清中含有其他引起RBC凝集的因素 反应时间过长，过度离心 标本抗凝不当，受检过程中出现凝血或出现小的纤维蛋白凝块 受检血清中含有不规则抗体 多凝集细胞的存在 器材或试剂被污染 定型试剂蛋白含量过高，引起钱串状形成,Rh血型鉴定的方法学评价,产生假阴性的原因 RBC悬液与定型血清比例失调 漏加或错加定型血清 定型血清的使用方法错误 离心后重悬细胞扣时，摇动用力过度，微弱的凝集被摇散 定型血清使用错误或保存不当导致失效 某些弱D抗原需通过抗球蛋白实验、吸收放散试验或基因分型等技
15、术才能检出,Rh血型鉴定的应用,常规Rh五个抗原（D、C、c、E、e）鉴定 亲子鉴定 移植配型等相关血型血清学检查,Rh血型的临床意义,输血反应Rh(-)输入Rh(+)血，会产生相应抗体，如再次输入Rh(+)会发生严重输血反应 新生儿溶血病多发生于Rh(-)母亲第二胎。Rh (-)接受Rh (+)输血或怀孕Rh(+)胎儿即产生相应的抗体(IgG型)而致敏，致敏后再次怀孕Rh(+)胎儿会引起严重的新生儿溶血病,三 交叉配血试验技术,交叉配血试验原理,主要检查受血者或献血者血清中是否存在破坏献血者或受血者红细胞的不规则抗体或补体依赖性红细胞抗体；并可以验证ABO血型鉴定是否正确，确保受血者和献血者
16、血液相容，防止发生急性或迟发性溶血性输血不良反应,交叉配血试验的要求,交叉配血试验也称配合性试验，实际上只是检查不配合性，使受、供者血液间没有可测的不相配合的抗原、抗体成分 交叉配血应在37孵育，除了盐水介质法外，至少还要有抗球蛋白试验，有条件的还可增加酶法、白蛋白介质、低离子强度（LISS）介质、微术凝胶技术等方法,交叉配血试验的应用,主侧管：受者血清2滴 +5%供者RBC悬液1滴 次侧管：供者血清2滴 + 5%受者RBC悬液1滴 阳性对照管：抗-D血清2滴 +5%RhD阳性O型试剂RBC悬液1滴 阴性对照管：AB型血清2滴 +5%RhD阳性O型试剂RBC悬液1滴,交叉配血试验常用的几种方法
17、,盐水介质法 酶介质法 抗球蛋白法 低离子聚凝胺法 微柱凝胶法,盐水介质实验原理,红细胞无凝 无溶血,红细胞凝集,红细胞凝集和/或溶血,受血者（献血者）血清献血者（受血者）红细胞,离心力,两血相容 可以输注,两血不相容 不可输注,盐水介质的不足,只能检出IgM性质的抗体 不能检出IgG性质的抗体,酶实验技术的原理,蛋白水解酶可作用于RBC表面的多糖链上，可切断带有负电荷的羧基基团的唾液酸，从而减少RBC表面负电荷以及RBC间的排斥力，缩短RBC间距，使之容易产生凝集反应,酶介质法原理,常用的酶,菠萝酶(Bromelin) 木瓜酶(DTT) 无花果蛋白酶(Ficin) 胰蛋白酶(Trypsin)
18、,无溶血 无凝集,凝集,溶血 凝集,交叉配血试验结果图例,酶试剂对抗原的影响,可以增强一些血型抗原与抗体的反应，其中以Rh和Kidd血型系统最为显著 也可使一些RBC抗原的结构破坏或变性，其中以M、N、S、Fya、Fyb最为显著，这时就可选用抗球蛋白技术检测 对一些碳水化合物结构为代表的抗原作用可以不变或是增强，如ABO、P1、Lewis、H、I等,抗球蛋白试验的原理,在盐水介质中，不完全抗体只能致敏RBC，而不能使RBC出现凝集 加入抗球蛋白试剂后，抗球蛋白分子的Fab片段与包被在RBC上的球蛋白分子的Fc片段结合，从而通过抗人球蛋白分子的搭桥而产生RBC凝集，未包被抗体的RBC不会凝集,抗
19、球蛋白试剂,广谱抗球蛋白试剂：主要抗IgG和抗C3d成分，可以含抗-C3b、-C4b和-C4d，抗IgA和抗IgM分子重链的成分单特异性抗球蛋白试剂：抗-IgG，抗-C3d、抗-C3b，分为IgG型、 IgG+C3型、C3型,间接抗球蛋白试验的原理,抗球蛋白的交联作用,检测结果示意,抗球蛋白试验假性原因,多操作步骤影响洗涤因素试剂失效（IgG抗体致敏RBC作对照）,低离子介质聚凝胺实验原理,低离子介质（Low Ionic Medium，LIM）降低溶液的离子强度，减少RBC周围的阳离子云，促进血清（浆）中的抗体与RBC相应抗原结合 聚凝胺（Polybrene） 带正电荷的高价阳离子多聚物，中和
20、RBC表面的负电荷，缩短细胞间距，形成可逆的非特异性聚集，并使IgG型抗体直接凝集RBC 解聚液/中和液 中和聚凝胺，非特异性聚集会因电荷而分散，由抗体介导的特异性凝集则不会分散,实验原理,聚凝胺试剂盒,聚凝胺介质交叉配血试验流程,LIM 混匀 聚凝胺 室温0.6 ml 室温1min 2滴 15s 3 000rpm 弃上清液 观察RBC是否 离心15s 管底留2滴液体 聚集形成凝块（ 无凝块，重做） 重悬液 混合 观察 2滴 结果,实验原理,加入聚凝胺 离心,加入重新悬 浮液,无抗体抗原反应 红细胞散开,有抗体抗原反应 红细胞凝集,试验的结果判读,阴性：凝块在1分钟内分散，供、受者血液配合阳性
21、：出现不同强度的凝块，供、受者血液不配合实验结果必须在三分钟内判读,聚凝胺法的缺陷,本实验对检出Kell系统抗体不理想，不能检出抗-K，对阴性结果要加做抗球蛋白实验，以免漏检 我国K基因频率几乎为0，kk型几乎为100%，至今未发现Kell系统抗体，因此聚凝胺法在我国广泛应用 而国外K基因频率为7-9%，用聚凝胺法易漏检，故少单用 肝素聚凝胺有抑制作用,方法学评价,快速简便，假阳性少 适用于急诊抢救患者的交叉配血,微柱凝集试验技术,1986年Lappierre发明的微柱凝集试验,是将人RBC血型抗原与相应的抗体发生的凝集反应在微柱检测系统中进行 目前常用有二种：凝胶和玻璃珠,微柱检测系统的组成
22、,反应室：柱的上端，加实验样本的空间检测管：反应介质：凝胶或小玻璃珠试剂：各种凝集反应所需，如促凝剂、定型试剂、抗球蛋白试剂等,微柱凝集试验技术的原理,凝胶或小玻璃珠的间隙形成了分子筛作用，只允许游离的RBC通过，凝集反应阳性的RBC凝块留在微柱凝集检测管的上面或中间，未凝集的游离RBC将通过凝胶或小玻璃珠的间隙，沉积在微柱凝集检测管的底部,实验材料,根据不同的血型血清学工作需要，选择相应的微柱凝集检测系统（严格按试剂说明选择和使用），微柱凝集离心系统，微量加液器，检测样本的RBC悬液，检测样本的血清或血浆，或试剂RBC悬液，定型血清和生理盐水等,操作流程,配制RBC悬液 加样加试剂 专用孵育
23、箱中孵育 在专用微柱凝集离心机中离心 判读凝集反应结果,微柱凝集交叉配血,配制: 0.8%RBC悬液(10l RBC+1ml 生理盐水) 主侧：50 l 0.8%献血者RBC + 25 l受血者血清（血浆） 次侧：50 l 0.8%受血者RBC + 25 l 献血者血清（血浆） 孵育: 37，15min 离心: 1000 rpm，10min,加样图示,结果判读,盐水介质的不足,只能检出IgM性质的抗体 不能检出IgG性质的抗体,酶试剂对抗原的影响,可以增强一些血型抗原与抗体的反应，其中以Rh和Kidd血型系统最为显著 也可使一些RBC抗原的结构破坏或变性，其中以M、N、S、Fya、Fyb最为显
24、著，这时就可选用抗球蛋白技术检测 对一些碳水化合物结构为代表的抗原作用可以不变或是增强，如ABO、P1、Lewis、H、I等,抗球蛋白试验假性原因,多操作步骤影响 洗涤因素 试剂失效（IgG抗体致敏RBC作对照）,聚凝胺法的缺陷,本实验对检出Kell系统抗体不理想，不能检出抗-K，对阴性结果要加做抗球蛋白实验，以免漏检 我国K基因频率几乎为0，kk型几乎为100%，至今未发现Kell系统抗体，因此聚凝胺法在我国广泛应用 而国外K基因频率为7-9%，用聚凝胺法易漏检，故少单用 肝素聚凝胺有抑制作用,微柱凝集试验技术的优点,新型的血型血清学检测技术 易于操作标准化、自动化、判读客观可靠、敏感度高 标本用量少、结果可长期保存、有利于大量样本操作 能检出B（A）或A（B）型而避免误定为AB型,微柱凝集试验技术的局限性,成本目前较高，不利于推广 不利于血型专业技术的积累和提高,微柱凝集试验技术的注意点,必须使用抗凝标本，否则易引起假阳性 孵育、离心时间较长，不适用于急诊 可能难于鉴别或漏检某些ABO亚型抗原 不适合于直接抗球蛋白试验阳性的RBC样本，也不适合于酶处理的RBC样本的检测工作 RBC悬液中如有颗粒物质，或血浆蛋白异常，干扰实验结果,微柱凝集试验技术的应用,ABO、血型鉴定 Rh血型鉴定 交叉配血 不规则抗体筛选 直接抗球蛋白实验 HDN,谢谢！,
