1、第七章 吸光光度法Spectrophotometry,7.1 概述,吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收 的分析方法，又称分光光度法。属于分子吸收光谱分析方法基于外层电子跃迁,吸收光谱 发射光谱 散射光谱,7.2 吸光光度法基本原理,1 物质颜色和其吸收光关系,单色光、复合光、光的互补,单色光,复合光,光的互补,单一波长的光,由不同波长的光组合而成的光,若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。,物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,吸收黄色光,光谱示意,表观现象示意,复合光,当光束照射到物质上时，不仅发生吸收或透射现象，还会
2、产生反射、散射。,界面反射损失,入射光束,透射光束,界面反射损失,溶液散 射损失,如被照射的是均匀溶液，则光的散射可以忽略。,光的波粒二象性,波动性,粒子性,， ,E,光的折射,光的衍射,光的偏振,光的干涉,光电效应,E：光子的能量（J）, ：光子的频率（Hz）, ：光子的波长（cm）,c：光速（2.99791010 cm.s-1）,h：Plank常数（6.625610-34 J.s ）,物质对光吸收的本质,一束光,能量,分子+h (原子),M + h = M* (基态) (激发态),h2(E),h3,3,不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同。仅当照射光光子提供的
3、能量(h)与被照物质的基态与激发态能量之差E相等时才能发生吸收。所以物质对光的吸收具有选择性。,E=E2-E1=h,物质或 溶液,分子内电子跃迁,带状光谱,纯电子能态间跃迁,锐线光谱,原子,分子,(a) 联苯(己烷溶剂)；,一些典型的紫外-可见吸收光谱,(b) 苯(己烷溶剂)；,(c) 苯蒸汽；,(d) Na蒸汽。,定性分析与定量分析的基础,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择吸收不同物质吸收光谱不同,在一定条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。,相同物质吸收光谱相同,吸收光谱或吸收曲线(absorption,spectrum)固定被测物质的浓度和吸光厚度，在不同的波长处测定其吸光度
4、。以吸光度为纵坐标，以测定波长为横坐标作图，即为吸收曲线。,吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小A l关系 最大吸收波长 l max：光吸收最大处的波长,2 一些基本名词和概念,l max,对比度( l):两有色络合物最大吸收波长(l MRmax) 之差, l,吸收曲线的讨论：,（1）而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max不同。 （2）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,（3）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似max不变。 （4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在max处吸光度A 的差异
5、最大，所以测定最灵敏。此特性可作为物质定量分析的依据。,1729年，Bouguer首先发现物质对光的吸收与吸光物质的厚度有关。 1760年他的学生Lambert更明确地指出：如果溶液的浓度一定，则光的吸收程度与液层的厚度成正比，这个关系称为朗伯定律。表示为：,一、吸光度(absorbance),3 朗伯-比尔定律,Ab,1852年，Beer指出：光的吸收与吸光物质的数量有关；如吸光物质溶于不吸光的溶剂中，则吸光度与吸光物质的浓度成正比。即当单色光通过液层厚度一定的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。这个关系称为比尔定律。,式中c：有色溶液浓度 k2：比例常数,Ac,a-为吸光系数，单位
6、为 L/g cm, b单位cm, c单位g / L ()-为摩尔吸光系数，单位为 L/molcm, c单位为mol/L,两项合并得：朗伯-比尔定律,是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于1mol/L吸光物质在1cm光程中的吸光度，是吸光物质吸光能力的量度。它可作为定性鉴定参数，也可反映方法灵敏度。,（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数； （2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变，在温度和波长等条件一定时， 仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关； （3）同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸收系数max表明了该吸收物质最大限度
7、的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。,灵敏度表示方法-,（4）可作为定性鉴定的参数； （5）物质的吸光能力的度量max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。 105：超高灵敏；吸光光度法中，一般要求 104 （6） 在数值上等于浓度为1 mol L-1、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。,与a 的关系,式中M为物质的摩尔质量。,经研究：当一束单色光，通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，其吸光度与吸光厚度和物质浓度成正比。,二、透光度T(transmittance),吸光度与透光度的关系,T ： 透光度,A： 吸光度,T,T =
8、 0.0 %,A = ,T = 100.0 %,A = 0.0,A = 0.434,T = 36.8 %,三、吸光度的加和性：,在多组分体系中，如果各种吸收物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和。,四、工作曲线,工作曲线又称标准曲线或较正曲线。绘制时先配制一系列具有不同浓度吸光物质的标准溶液，然后在确定的波长和吸光厚度(光程)等条件下，分别测量其吸光度。以吸光度A为纵坐标，标准物质的浓度c为横坐标作图，即为工作曲线。,吸光度与光程的关系 A = kbc,吸光度与浓度的关系 A = kbc L2L1,例: 1.有一溶液,在max=310 nm处的透光率为87%，在该波长处时的吸
9、光度为多少？ 解：T87；AlgTlg870.06 2.已知苯胺的max=280 nm, =1430,有一含苯胺的水样，在1 cm比色皿中测得吸光度为0.52，求该水样中苯胺的含量。（以mg/L表示) 解:,3.某有色化合物的0.0010%水溶液,在510 nm处,用 3 cm比色皿测得吸光度为A=0.57,已知摩尔吸光系 数为2.5103 L/molcm,求该有色配合物的摩尔质 量。 解：,4 偏离比耳定律的原因,1. 现象标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。,2. 引起偏离的因素（两大类）（1）物理性因素，即仪
10、器的非理想引起的；（2）化学性因素。,（1）物理性因素：,LB定律基本假设：入射光为单色。实际上仪器发出的入射光是波长范围较窄的光带组成的复合光。设由1和2两束光组成，其吸光度分别为A和A”。,对1,对2,1 非单色光引起的偏离,测定时入射光的总强度为(I0+I”0）,透射光的总强度 为(I1+I2)，因此所得吸光度值为：,将I1和I2代入得：,可见，1=2 时，A=bc，A与c成直线关系。 如果12 ，A与c则不成直线关系。 1，2 差别愈大，A与c之间的线性关系偏离也愈大。,尽量选取吸光度随波长变化不大的谱带进行测量(A)，则A随波长变化小，的变化小，引起的偏离小，A与c基本为直线。若选用
11、谱带B的复合光进行测量， 的变化大，A与c的线性关系也差。,那么，我们如何选用入射光波长？,选取谱带A处作入射波长，还可保证吸光度最大，灵敏度最好。,2、非平行入射光引起的偏离,朗伯-比尔定律要求入射光平行垂直入射。若入射光束为非平行光，可能导致工作曲线产生正偏离。,3、介质不均引起的偏离,朗伯-比尔定律要求吸光物质溶液：均匀的、非散射的。若溶液不均，如产生胶体或浑浊，当入射光通过该溶液时，除了一部分光被吸收外，还有一部分因散射而损失，使实测的吸光度偏高，从而使工作曲线产生正偏离。,(2) 化学性因素,L-B定律的基本假设要求溶液中吸光质点是独立的，彼此间无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定
12、律。高浓度时(0.01 mol/L)，由于吸收组分粒子之间的平均距离减小，相互影响邻近粒子的电荷分布，使吸光能力发生变化。即改变物质的摩尔吸光系数()。其相互作用的程度与浓度有关，浓度增大，吸光度与浓度之间的关系偏离线性关系越大。所以一般认为比尔定律仅适用于稀溶液。,1、高浓度引起的偏离,Cr2O72- + H2O = 2H+ + 2CrO42- （橙色） （黄色）,L-B中浓度(c) 应指吸光物质的平衡浓度，即吸光型体的平衡浓度。实际常用吸光物质的分析浓度。只有当平衡浓度等于或正比于分析浓度时，其吸光度才符合郎比定律。但溶液中吸光物质常因缔合、离解、互变异构，络合物的逐级形成，以及与溶剂的相
13、互作用等而形成新的化合物或改变吸光物质浓度，这些都将导致偏离比尔定律。如,2、化学反应引起的偏离,7.3 吸光光度分析方法及仪器,1、目视比色法,一、比色法,c1,c2,c3,c4,比色管,cx,以眼睛比较溶液颜色的深浅以测定物质含量的方法，称为目视比色法。常用的目视比色法是标准系列法,优点：设备简单，操作简便，不要求有色溶液服从郎比定律，广泛用于准确度要求不高的常规分析中。 缺点：准确度不高，如溶液中存在第二种有色物质，无法测定。许多有色溶液不稳定，标准系列不能久存，经常用时配制，麻烦。,2、光度计及基本部件,光电比色法：使用光电比色计测定溶液，进行定量分析的方法,分光光度法：使用分光光度计
14、测定溶液，进行定量分析的方法,两种方法的测定原理相同，只是获得单色光的方法不同，前者用滤光片，后者用棱镜或光栅等单色器。由于两者均基于吸光光度测定，统称为光度分析法。国产分光光度计类型主要有：72、721、722和725型。其主要部件和光路示意图如下。,光源,单色器,吸收池,检测系统,参比池,紫外可见分光光度计,1.光源；2.滤光片；3.聚光镜；4.狭缝；11.反射镜；5.准直镜；6.光栅；7.狭缝；8.聚光镜；9.比色池；10.光电管,光度计中的光路,分光光度计的主要部件,光源,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,单色器,单色光的纯度取决于棱镜的色散率和出射狭缝的宽度。玻璃棱镜对400
15、1000nm波长的光色散较大，适用于可见光分光光度计。,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。,原理： 利用光通过光栅时 发生衍射和干涉现象而分光.,优点：具有色散均匀、工作波长范围宽、分辨率高等特点，一般用于中高档仪器中。,样品池（比色皿）厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5cm材质：玻璃比色皿可见光区 石英比色皿可见、紫外光区,硒光电池,检测器,3、分光光度计的类型,7.4 显色反应及影响因素,要求： a. 选择性好 b. 灵敏度高 (104) c. 产物的化学组成稳定 d. 化学性质稳定 e. 反应和产物有明显的颜色差别
16、(60nm),没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定 显色反应,一、 显色反应,二、 显色剂,无机显色剂:配合物,有机显色剂:螯合物,例：铁（III）与有助色团和无助色团的有机试剂反应所得产物颜色的比较,SCN- Fe(SCN)2+ H2O2 TiOH2O22+,苯和硝基甲烷有颜色吗？,使化合物分子的吸收峰波长向长波长方向移动,有机显色剂的类型,1. 偶氮类显色剂：分子中含有偶氮基。这类化合物都是有色的。具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择 性好、对比度大等优点。是目前应用最为广泛的一类显色剂。如偶氮胂III和PAR。,偶氮伸III,PAR：4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚
17、,2. 三苯甲烷类显色剂：,这是一类应用很广的分析试剂，种类很多。铬天青可与许多金属离子形成三元配合物，用于吸光度测定，常用来测铍和铝。,5-(3-羧基-5-甲基-4-氧代-2,5-环己二烯-1-亚基)(2,6-二氯-3-磺基苯基)甲基（铬天青S ）,2、对光有较大的吸收容量，进行光度测定时，它比二元络合物具有更高的灵敏度和更大的对比度。 3、形成三元配合物的显色反应比二元体系具有更高的选择性。,三元配合物特点：,1、比较稳定，可提高分析测定的准确度和重现性。,有机显色剂,OO型：,ON型：,PAR,S型：,双硫腙,NN型：,丁二酮肟,邻二氮菲,磺基水杨酸,三、 显色反应的影响因素,c(R),
18、c(R),c(R),a. 显色剂用量（c(M)、pH一定）,Mo(SCN)32+ 浅红 Mo(SCN)5 橙红 Mo(SCN)6- 浅红,Fe(SCN)n3-n,酸度改变引起平衡移动，影响显色剂及有色配合物的浓度，还可能引起配位基团 (R)数目的改变，从而改变溶液的颜色。酸度还与金属离子水解有关。适宜酸度范围是通过实验来选择的。,R- + Mn+ = MRn,显色剂,有色配合物,b. 酸度,显色反应一般在室温下进行，有时加热可使显色反应完全，一般是通过实验找出适宜温度。,大多数显色反应需要一定时间，时间长短有时与温度有关，一般可由吸光度时间关系曲线得到。,c. 显色温度,d. 显色时间,光度分
19、析中，共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，都将干扰测定。 消除方法： (1)加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子生成无色络合物或无色离子。 (2)选择适当的显色条件以避免干扰。 (3)分离干扰离子。 (4)可选择适当的光度测定条件(波长和参比)，消除干扰离子的影响。,e. 干扰的消除,一、入射光波长的选择,原则：1、最大吸收max2、吸收最大，干扰最小,max,二、参比溶液的选择,测定时，用参比溶液调节仪器零点，可消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并扣除干扰的影响。,灵敏度,选择性,7.5 吸光度测定条件的选择,参比类型：,1、溶剂空白。(只有待测物质
20、与显色剂的反应产物有吸收，溶剂做参比) 2、试剂空白。(显色剂和产物有色而其他无色，显色剂、溶剂做参比) 3、样品空白。(反应物有色或浑浊，反应物、溶剂做参比),此时,通过参比溶液的透射光,三、吸光度读数范围的选择,透光度（T）在1080%（即A在0.11.0）范围内的C/C比较小。因此测定时应使被测试液的吸光度在此范围内才能得到较好的结果。当T=36.8%时，A=0.434时测量误差最小。,7.6 吸光光度分析的应用,一、高含量组分的测定示差法,方法原理：若测定试液浓度为(Cx) ，用稍低于试液浓度的(Cs)标准溶液作参比溶液，调节仪器透光度读数为100%（A=0)，然后测定其吸光度(Ar)
21、(相对吸光度)，对应的透光率称相对透光率(Tr)，则有：,示差法要求：仪器光源有足够的发射强度或能增大光电流放大倍数,以便能调节参比溶液透光率为100%。,二、多组分分析,(1)吸收光谱不重叠，或至少可以找到某一波长时X有吸收而Y不吸收，在另一波长时，Y吸收而X不吸收。 如图1，可分别在波长1和2时，测定组分X和Y而相互不干扰。,假定溶液中同时存在两种组分X和Y，它们的吸收光谱一般有如下两种情况：,(2)吸收光谱重叠：找出两个波长，在该波长下，二组分的A较大，如图2，在波长1和2时测定吸光度A1和A2，由加和性得方程式：,解方程可得：cx 和 cy,三、双波长分光光度法,1、原理,利用两束不同
22、的单色光交替照射同一吸收池，测定并记录两者吸光度的差值A 。这样可从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号，消除各种干扰，求得待测组分的含量。,1,2,A,设波长为1和2的两束单色光的强度相等，则：,因只用一个吸收池，且以试液本身对某一波长的光的吸收为参比，因此消除了因试液与参比液及两个吸收池之间的差异所引起的测量误差。提高了准确度。,2、应用,1）多组分混合物的测定 2）混浊样品的测定 3）反应动力学研究,图16为X、Y两组分的吸收光谱曲线，测定 试液中Cx时选1和2作测定波长和参比波长。Y在两个波长处吸光度相等，即：,故由双波长光度计测得：,可见A与Cx成正比而与CY无关，从而消除了组分Y
23、的干扰。,对于1,对于2,四、酸碱离解常数的测定,对一元弱酸HL,配制一系列总浓度为c，而pH值不同的溶液，用酸度计测定各溶液pH。在某酸度的最大吸收波长处，用1cm比色皿测定各溶液吸光度A，则：,引入分布系数：,(1),(2),整理得：,认为高酸度时(pHPka-2)，弱酸全部以酸式存在(c=HL)，吸光度为AHL，则：,同理低酸度时(pHPka+2) ，弱酸全部以碱式存在(c=L-)，吸光度为AL，则：,(3),(4),将式(3)、(4)代入(2)中,五、络合物组成及稳定常数的测定,1、摩尔比法,固定CM，逐渐增加CL，测定一系列Cm一定、 CL不同的溶液的吸光度A。以A为纵坐标， CL/
24、 Cm为横坐标作图。,当CL/CMn时，A不再改变。两条切线的交点所对应的横坐标CL/CM比值为n，则络合物的络合比为1:n。,1,2,2、等摩尔连续变化法,方法原理：保持(cM+cR)一定，连续改变cR/cM，配制出一系列显色溶液，分别测定系列溶液的吸光度A，以A对cM/(cM+cR)作图(下图)。,曲线的折点所对应的cR/cM值就等于络合物的络合比n。当络合物较稳定时，曲线的折点明显，反之，则应用切线外推法得到折点。,适合于络合比较低，稳定性较好的络合物组成的测定。,此法还可测定络合物的离解度。B点对应的吸光度A相当于配合物完全不离解时溶液的吸光度A，由于络合物部分离解，对应的吸光度为A，
25、其离解度计算为：,3、络合物稳定常数的测定,CM = M + ML CL = L + ML,如金属离子M和络合剂L在吸收波长处均无吸收， 则：A=ML ML (b=1cm),如若形成1:1络合物时，n=1，根据物料平衡,CL/CM 比值较高时，M基本完全转化为ML，其吸光度为A0，这时CMML，故ML= A0 / CM,测定反应不完全时溶液的吸光度A和CM 、CL数据可计算各平衡浓度M和L，并由此得到稳定常数：,1、在吸收光度法中，It /I0定义为透过光强度与入射光强度之比，称为（ ） A 吸光度 B 透光度 C 百分透光率 D 消光度 2有两个完全相同的1cm厚度的比色皿，分别盛有甲、乙两
26、种不同浓度同一有色物质的溶液，在同一波长下测得的吸光度分别为甲0.260，乙0.390，若甲的浓度为4.4010-3 mol/L，则乙的浓度为（ ） A 2.2010-3mol/L B 3.3010-3mol/L C 4.4010-3 mol/L D 6.6010-3mol/L 3分光光度法测定中，使用比色皿时，以下操作正确的是（ ） A比色皿的外壁有水珠 B手捏比色皿的毛面 C手捏比色皿的磨光面 D用卫生棉擦去比色皿外壁的水珠 E待测液注到比色皿的2/3高度处,B,D,CDE,4标准曲线法在应用过程中，应保证的条件有（ ） A至少有57个点； B所有的点必须在一条直线上； C待测样品浓度应包
27、括在标准曲线的直线范围之内； D待测样品必须在与标准曲线完全相同的条件下测定，并使用相同的溶剂和显色系统 E测定条件变化时，要重新制作标准曲线。 5将下列各百分透光率（T%）换算成吸光度（ ） （1）38% （2）7.8% （3）67% （4）55% （5）0.01% 6取1.000g钢样溶解于HNO3，其中的Mn用KIO3氧化成KMnO4并稀释至100mL，用1.0cm吸收池在波长545nm测得此溶液的吸光度为0.720。用1.6410-4 mol/L KMnO4作为标准，在同样条件下测得的吸光度为0.360，计算钢样中Mn（55）的百分含量。,ACDE,0.18%,7某化合物的摩尔吸光系数为13000 L/molcm，该化合物的水溶液在1.0cm吸收池中的吸光度为0.425，试计算此溶液的浓度。 8已知某溶液中Fe2+ 浓度为150g/100mL，用邻菲罗啉显色测定Fe2+，比色皿厚度为1.0cm，在波长508处测得吸光度A0.297，计算Fe2+邻菲罗啉络合物的摩尔吸光系数。9已知石蒜碱的分子量为287，用乙醇配制成0.0075%的溶液，用1cm吸收池在波长297nm处，测得A值为0.622，其摩尔吸收系数为多少？,3.2710-5,(=1.1104),(=2380),
