1、环境友好型消毒剂二氧化氯在植物外植体消毒中的应用研究段永波 1,周莹莹 1,李凤兰 2,陈文良 3,赵丰兰 1,盛 玮 1,张爱民 1,滕井通 1,薛建平 1, * （1. 淮北师范大学生命科学学院/资源植物生物学安徽省重点实验室 淮北 235000；2. 北京必洁仕环保新技术开发有限公司 北京 101102；3. 北京市农林科学院 北京 100097） * 通讯作者。E-mail: 摘要：外植体表面消毒是植物组织培养中试验材料转为无菌状态的第一环节。目前常用的消毒剂氯化汞和次氯酸钠均有一定弊端，因此探索新型的植物外植体消毒方法非常重要。本研究以二氧化氯消毒剂为研究对象，调查其在禾谷类作物水
2、稻种子、草本植物雪莲果和木本植物石榴外植体消毒上的应用潜力。结果表明，80.0133.0 mg/L ClO2处理水稻种子消毒效果较好，出愈率超过 90%且所诱导愈伤质量较好；28.633.3 mg/L二氧化氯处理雪莲果嫩叶后，愈伤组织诱导率接近80%，与0.1%HgCl处理结果相近。石榴的消毒试验中，25400 mg/L二氧化氯处理后嫩叶均脱色褐化死亡，而0.1%HgCl处理组材料生长良好，但二氧化氯低于80%时，部分石榴材料被污染。二氧化氯作为一种环境友好的新型消毒剂，具有替代0.1%HgCl在某些植物外植体消毒上应用的潜力。关键词：二氧化氯；组织培养；水稻；雪莲果；石榴前言 在植物组织培养
3、过程中，外植体消毒是材料从带菌环境转为无菌状态的关键步骤。目前植物组培中最常用的消毒剂为氯化汞和次氯酸钠。然而，汞为重金属元素，对环境和人体都有极大的负面影响，同时国家严禁汞消毒废液排入下水道，无害化处理操作繁琐；次氯酸钠消毒反应后产生三氯甲烷等致癌物和氯代酚等毒性物质（Gunten 等，2001；刘勇建等， 2004） ，同样威胁着环境安全和人类健康。因此，探索安全、高效和环境友好的新型植物外植体表面消毒剂意义重大。 二氧化氯为一种强氧化剂，最早由英国化学家 Humphrey Davey 通过氯酸钾水溶液和盐酸反应生成，对微生物细胞壁有较强的吸附穿透能力，能有效氧化细胞内含巯基的酶并抑制微生
4、物蛋白合成来杀灭微生物（韦明肯等，2012） 。二氧化氯与有机物及无机物反应时均具有很强的选择性，不产生发散性有机卤化物（TOX ）和具致癌作用的三卤甲烷（TMH） 。因此，世界卫生组织（WHO）推荐二氧化氯为安全消毒物质中的 A1 级产品（张含松， 2003） 。关于二氧化氯在作饮用水消毒（代园园等，2011） 、农业生产（郑宏海等，2000；王化鹏等，2003；高宝岩等，2008；张明月等，2012） 、水产品加工（史建华等，2006） 、果蔬保鲜（潘永贵，2003；张顺和和张超，2006）及食品工业（蔡慧农和汤凤霞，2003）等领域应用的研究较多。然而，目前二氧化氯应用于植物组织培养中外
5、植体消毒的报道不多。 由于生长环境和材料本身差异，各种植物表面携带菌类和内生菌种类均不同，因此探索各自适合的消毒方法很有必要。本研究以二氧化氯消毒剂为研究对象，调查其在禾谷类作物水稻种子、草本植物雪莲果和木本植物石榴外植体消毒上的应用潜力，为探索新型植物组培消毒方法提供参考。1 材料与方法1.1 实验材料 禾本科植物水稻种子由本研究组种植并保存；草本植物雪莲果幼茎嫩芽取自淮北师范大学南山博士工作站试验地；木本植物石榴幼茎嫩芽采自淮北师范大学校园。二氧化氯消毒剂由北京必洁仕环保新技术开发有限公司提供。氯化汞为武汉福德化工有限公司产品。1.2 实验方法1.2.1 二氧化氯消毒剂配制将 1 片 A
6、剂药片溶于 50ml 无菌水，完全溶解后加入 5ml B 剂，立即盖好瓶盖，5 分钟后再加无菌水至 500ml，获得二氧化氯消毒剂原液（400mg/L ） 。将原液进行系列倍数稀释，配制不同浓度二氧化氯消毒剂（现配现用） 。具体浓度如下：1 倍（200.0 mg/L） 、3 倍（133.0 mg/L） 、5 倍（80.0 mg/L） 、7 倍（57.1 mg/L） 、9 倍（44.4 mg/L） 、10 倍（40.0 mg/L） 、12 倍（33.3 mg/L） 、14倍（28.6 mg/L） 、16 倍（25.0 mg/L） 。 1.2.2 实验材料的预处理挑取饱满、无病斑、胚完整的水稻种子
7、用于表面消毒实验；雪莲果和石榴嫩叶经流水冲洗 30 min，无菌滤纸吸干表面水分后进行消毒实验。 1.2.2 外植体消毒方法水稻种子于所试各浓度的二氧化氯溶液浸泡 25 min（期间不时摇动） ，吸干表面水分后接种至愈伤诱导培养基 NB（Duan 等 , 2012） ，各培养皿接种 20 粒种子。雪莲果嫩叶经预处理后置于各浓度的二氧化氯溶液浸泡 25 min（期间不时摇动） ，吸干表面水分后接种于愈伤诱导培养基（MS+2,4D 2.0 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂 7g/L，pH5.8）培养基，各培养瓶接种 10 个外植体。石榴嫩芽在经预处理后置于各浓度的二氧化氯溶液浸泡 25 min（期
8、间不时摇动） ，吸干表面水分后接种于愈伤诱导培养基（MS+NAA 0.5 mg/L+6BA 1.0 mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 7g/L，pH5.8） ，各培养瓶接种 10 个外植体。上述各试验均设置以浸泡于0.1%氯化汞溶液 6 min 为对照组，无菌水冲洗 5 次后吸干水分，接种于相应培养基，接种数量与各试验组一致。各处理均重复 3 次。水稻种子置于 30黑暗培养，雪莲果嫩叶和石榴嫩芽于 22黑暗培养。每天观察染菌情况并及时移走染菌材料，培养 10 d 后统计污染外植体数并拍照，20 d 后观察材料生长情况。1.2.3 数据统计污染率和死亡率计算按下式进行：污染率=污染外植体数/接种
9、外植体总数 100%死亡率=死亡外植体数 /接种外植体总数 100%出愈率=出愈外植体数 /接种外植体总数 100%所有数据均以 3 次平行实验的平均值标准差（MeanSd）表示。方差分析采用 Duncans 软件进行。 2 结果与分析2.1 水稻种子消毒效果在水稻组织培养中，以种子作为外植体诱导愈伤组织并进行再生培养是最常用的途径。因此探索水稻种子表面消毒的新方法尤为重要。本研究以水稻品种日本晴为试验材料(图 1A)，探讨不同浓度二氧化氯溶液在水稻种子消毒中的应用潜力。由表 1 可知，随着 ClO2 浓度逐步升高，种子污染率呈现降低趋势。当 ClO2 浓度高于 80.0 mg/L 时，污染率
10、均低于 10.0%。在 ClO2 浓度 80.0133.0 mg/L 处理组中，种子出愈率均超过 90%（92.3%93.3%） ，表明该浓度范围较适合于水稻种子外植体表面消毒。同时，采用 ClO2 进行表面消毒的材料愈伤组织呈鲜黄色、质地松脆，适合于继代培养或外源基因转化（图 1B） 。该试验结果表明，二氧化氯能用于水稻种子外植体消毒，且消毒处理不影响后期水稻组织培养，具有于氯化汞消毒相当的效果。图1 试验所用水稻日本晴及所诱导的愈伤组织注：A，用于试验日本晴种子；B，80.0 mg/L ClO2 消毒后于愈伤诱导培养基培养 3 周。表 1 不同处理下水稻种子消毒效果处理接种种子数污染种子数
11、污染率 (%)萌发数萌发率(%)出愈种子数出愈率(%)0.1% HgCl2 90 0 0 87 96.7 80 88.9400.0 90 3 3.3 86 95.6 72 80.0200.0 90 4 4.4 87 96.7 73 81.1133.0 90 5 5.5 90 100.0 84 93.380.0 90 6 7.8 90 100.0 83 92.357.1 90 23 25.6 90 100.0 65 72.244.4 90 35 38.9 90 100.0 63 70.040.0 90 33 36.7 90 100.0 65 72.2ClO2 (mg/L)33.3 90 32 3
12、5.6 90 100.0 64 71.128.6 90 38 42.2 90 100.0 60 66.725.0 90 43 47.8 90 100.0 55 61.12.2 雪莲果嫩叶消毒效果雪莲果原产于美洲，为当地印第安人的主要食物来源。其所含糖分主要低聚果糖（Lachman 等，2003） ，为糖尿病患者提供了一适合的糖类物质。雪莲果为菊科多年生草本植物，在长日照条件下可开花，但不结籽粒，主要以块种进行无性繁殖。因此，雪莲果的组织培养多以嫩叶作为外植体进行表面消毒(图 21)。由表 2 可知，在 0.1% HgCl2 对照组中， 未出现材料污染和死亡情况，出愈率为 76.7%(图 2B)
13、。当 ClO2 浓度为 25.0 mg/L 时，雪莲果嫩叶污染率为23.3%；而在高于该浓度的其他试验组中，外植体污染率均为 0。但当 ClO2 浓度高于 40.0 mg/L 时，部分外植体死亡，且死亡率随着浓度增加呈现升高趋势。在二氧化氯浓度为 28.633.3 mg/L 时，出愈率达 78.3%80.0%(图 2C)。该研究结果表明，28.633.3 mg/L 二氧化氯可代替氯化汞进行雪莲果外植体消毒，且不影响后续研究。 图 2 试验所用雪莲果嫩叶和消毒效果注：A，雪莲果嫩叶；B，0.1%氯化汞消毒嫩叶； C，33.3 mg/L 二氧化氯消毒嫩叶。 表 2 不同处理下雪莲果嫩叶消毒效果处理
14、接种外植体数污染外植体数污染率(%) 死亡外植体数死亡率(%)出愈外植体数出愈率(%)0.1% HgCl2 60 0 0 0 0 46 76.7400.0 60 0 0 17 28.3 14 23.3200.0 60 0 0 16 26.7 16 26.7133.0 60 0 0 16 26.7 14 23.380.0 60 0 0 15 25.0 19 31.657.1 60 0 0 15 25.0 23 38.344.4 60 0 0 10 16.7 25 41.740.0 60 0 0 11 18.3 23 38.333.3 60 0 0 0 0 47 78.328.6 60 0 0 0
15、 0 48 80.0ClO2 (mg/L)25.0 60 14 23.3 0 0 40 66.72.3 石榴嫩叶消毒效果石榴为一种多年生灌木或乔木植物，内生真菌较多，研究中常以新生嫩芽为试验材料(图 3A)。0.1% HgCl2 对照组外植体生长良好 (图 3B)。所有参试浓度的 ClO2 溶液处理组中，石榴嫩芽或嫩叶，外植体材料均无法存活，色素渗入培养基，且 ClO2 浓度越高褐化越严重(图 3C)。 图 3 试验所用石榴嫩叶和消毒效果 由表 3 可知，在高于 80.0 mg/L ClO2 浓度处理试验组中，所有材料均未被污染；当 ClO2 浓度低于 57.1 mg/L 时，实验材料出现污染
16、的情况，且污染率随着 ClO2 浓度降低逐步增加。该试验结果表明，适合的二氧化氯浓度能较好的杀灭石榴嫩叶表面微生物，然而在所试验的 25400 mg/L 二氧化氯处理组中，所有材料都因色素流失而死亡。表明二氧化氯不适合于石榴嫩叶的表面消毒，须探索其其他类型组织作为外植体。表 3 不同处理下石榴嫩叶消毒效果处理接种外植体数污染外植体数污染率(%)死亡外植体数死亡率(%)出愈外植体数出愈率(%)0.1% HgCl2 60 0 0 0 0 35 58.3400.0 60 0 0 60 100.0 0 0200.0 60 0 0 60 100.0 0 0133.0 60 0 0 60 100.0 0
17、080.0 60 0 0 60 100.0 0 057.1 60 23 38.3 60 100.0 0 044.4 60 30 50.0 60 100.0 0 040.0 60 41 68.3 60 100.0 0 033.3 60 40 66.7 60 100.0 0 028.6 60 44 73.3 60 100.0 0 0ClO2 (mg/L)25.0 60 52 86.7 60 100.0 0 03 讨论植物组织培养中，造成材料污染的原因包括接种污染、培养过程污染和外植体自身携带微生物（蔡慧农和汤凤霞，2003；代园园等，2011） ，其中前两类都可改变操作和试验条件得以解决，而第三类
18、则必须通过严格的外植体表面消毒加以控制。当前常用的外植体消毒剂氯化汞和次氯酸钠对环境和人体都有一定负面作用，因此探索新型的植物外植体消毒方法极为重要。二氧化氯作为一种新型消毒剂，在反应后不会产生对环境和人体有害的物质，已广泛应用于自来水消毒和蔬菜保鲜等人类生产生活密切相关的领域（蔡慧农和汤凤霞，2003；代园园等，2011） 。二氧化氯能有效杀灭微生物，推测其也能在植物外植体表面消毒中发挥作用。梁贤钾等（2003）曾探索过二氧化氯在小水榕外植体消毒中的应用，发现300 mg/L 二氧化氯处理 30min能获得较好的无菌外植体。由于不同植物所携带微生物种类和数量均有差异，很有必要探索二氧化氯在不
19、同类型的植物外植体表面消毒中的应用。本研究中，80.0133.0 mg/L ClO2处理水稻种子消毒效果较好，出愈率超过 90%且所诱导愈伤质量较好；28.633.3 mg/L二氧化氯处理雪莲果嫩叶后，愈伤组织诱导率接近80%，与0.1%HgCl处理结果相近。该结果表明，适合浓度的二氧化氯可代替氯化汞进行水稻种子和雪莲果嫩叶外植体消毒，且不影响后续研究。石榴的消毒试验中，25400 mg/L二氧化氯处理后嫩叶均脱色褐化死亡，而0.1%HgCl处理组材料生长良好，这可能与石榴所富含的酚类物质有关。但二氧化氯低于80%时，部分石榴材料被污染，推测该试剂可能不适合于石榴的外植体消毒，或需采用其他外植
20、体类型。综上，二氧化氯作为一种环境友好的新型消毒剂，具有替代0.1%HgCl在某些植物外植体消毒上应用的潜力。参考文献Gunten U V, Driedger A, Gallard H, Salhi E. Byproducts formation during drinking water disinfection: A tool to assess d is infection efficiency J. Water Research. 2001, 35(8): 20952099.刘勇建, 牟世芬, 林爱武, 等. 北京市饮用水中溴酸盐、卤代乙酸及高氯酸盐研究J. 环境科学. 2004, 2
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