1、动物细胞培养和核移植技术,专题2 动物细胞工程,动物细胞培养,动物细胞融合,生产单克隆抗体,动物细胞核移植,动物细胞工程常用技术,其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,动物细胞培养和 核移植技术,一、动物细胞培养,动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,1、概念：,原理：,细胞增殖,动物细胞培养过程：,原代培养,传代培养,1、动物细胞培养过程,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶或胶原蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等
2、蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（水解弹性纤维）,有关概念:,原代培养：指将要培养的动物细胞取出后,先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞,然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中培养。,传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,动物细胞生长特点：,细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,细胞贴壁过程,那么什么
3、是接触抑制？,接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。,接触抑制,动物细胞生长特性,部分细胞突变，获得不死性，向癌细胞方向发展，糖蛋白减少。,为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们的细胞分化程度低，增殖能力强，分裂旺盛，容易培养。,一、动物细胞培养过程,胚胎是专指有性生殖而言，是指雄性生殖细胞和雌性生殖细胞结合成为合子之后，经过多次细胞分裂和细胞分化后形成的有发育成生物成体的能力的雏体,为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料
4、？,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们的细胞分化程度低，增殖能力强，分裂旺盛，容易培养。,一、动物细胞培养过程,为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？,分散的单个细胞容易摄取所需的营养，排出代谢废物；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难。,胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？,胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。,一、动物细胞培养过程,胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.28.4。多数动物细胞培养的适宜pH为
5、7.27.4。,1、无菌、无毒,2、营养（培养基成分）,3、适宜的温度和PH值,4、必要的气体条件,（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、 血清、血浆等。）,O2和CO2,3、条件：,添加一定量的抗生素 定期更换培养液 培养液和培养器具无菌处理,培养基的不同是动物细胞培养和植物组织培养最重要的区别,36.5 +0.5度 PH为7.2-7.4,CO2的主要作用是维持培养液的PH,动物细胞培养基中为什么要加入动物血清?加入动物血清的作用是什么?,血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液
6、提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子,血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的血清.,4、应用,大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体） 基因工程的受体细胞 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性 用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植株,培养结果,获得细胞或细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,动物血清、血浆,植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培
7、养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,既然动物体细胞核仍具有全能性，为什么不能直接利用动物体细胞培育动物体？,想一想,利用动物体细胞核移植技术,动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。,怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？,将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）,分 类,细胞分化程度低，恢复全能性容易,细胞分化程度高，恢复全能性不容易,概念：,1.动物细胞核移植的概念、种类：,克隆动物,用核移植方法得到的动物,
8、克隆步骤上,克隆步骤下,阅读与思考,以概念图的形式表示体细胞核移植过程？,取供体细胞,取卵母细胞,供体细胞培养,培养到 M中期,卵母细胞去核,供体细胞注入去核的卵母细胞,供体核进入受体卵母细胞,重组胚胎,代孕母牛,生出与供体遗传物质基本相同的个体,无性生殖,2、为什么不是取供体细胞核进行核移植操作，而是直接将供体细胞整个注入去核卵母细胞中？,保证供核不被破坏，使所得个体的性状更符合供体。,想一想,1、受体细胞为什么选用卵母细胞？,卵母细胞体积大，易操作，而且含有促使细胞核表达全能性的某种物质和营养物质。,2.体细胞核移植的过程,P49 讨论：,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用
9、价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。,2.体细胞核移植技术的应用前景,1、在畜牧业中可 以加速家畜遗传 改良的进程.,2、保护濒危物种.,3、
10、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植.,克隆动物的研究意义,1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白 2.改良动物品种 3.治疗人类疾病，作为供体 4.保护濒危动物,3.体细胞核移植技术存在的问题,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。 成功率非常低及克隆动物食品的安全性问题。,体细胞核移植技术存在的问题,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂
11、贵，距大规模应用还有一定距离。,例：克隆羊,另一头绵羊的子宫,2.体细胞核移植的过程：,细胞核移植,多莉羊的培育过程,核移植技术,1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是 A细胞系 B细胞株 C原代细胞 D传代细胞,2、动物细胞工程技术的基础是 A.动物细胞融合 B.单克隆抗体 C.胚胎移植 D.动物细胞培养,A,D,3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 A.容易产生各种变异 B.具有更强的全能性 C.取材十分方便 D.分裂增殖的能力强,D,4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于 A.培养基不同； B.动物细胞培
12、养不需要在无菌条件下进行； C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能； D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。,A,1.动物细胞培养要经过脱分化吗？为什么？2.体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,课堂反馈,克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。所以，用教材中所述的方法克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能
13、和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,知识结构,动物细胞培养和核移植技术,动物细胞培养,动物体细胞核移植技术和克隆动物,核移植技术和克隆动物的概念,体细胞核移植技术的过程,体细胞核移植技术的应用前景,体细胞核移植技术存在的问题,细胞核移植,多莉羊的培育过程,核移植技术,动物细胞
14、培养概念：,动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。,1.动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官 和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,3.动物细胞培养技术的应用,1.蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.健康细胞培养 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植 3.细胞的生理、药理、病理研究,思考：,2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,、动物细胞培养能否
15、像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：液体培养基 成分中有动物血清等,因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,细胞的全能性,细胞增殖,植物组织培养和动物细胞培养的比较,固体培养基,液体培养基,蔗糖 植物激素,葡萄糖 动物血清,植物体,细胞株、细胞系,快速繁殖、培育无病毒植株,获得细胞或细胞分泌蛋白,供体细胞 （供核）,细胞培养,体细胞,卵巢卵母细胞（M中期：供质）,去核,无核卵 母细胞,注入,细胞 融合,重组细胞,构建重组 胚胎,胚胎 移植,代孕 母体,
16、生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛,归纳: 1.共分成两大阶段：核移植和胚胎移植 2.取卵细胞作受体细胞的原因是:它是最大的细胞,易操作,它发育可直接表达性状 3.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状,核移植过程,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中。使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。,克隆动物,用核移植方法得到的动物,1、动物核移植：,克隆动物,用核移植方法得到的动物,皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要
17、植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，1014天后就要被身体排斥。,如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？,人耳鼠,“人耳鼠”再出风头 2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院
18、长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。,在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。,人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？,动物细胞培养基中为什么要加入动物血清?加入动物血清的作用是什么?,血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物
19、质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的血清，动物血清还可起到酸碱度缓冲液的作用.,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。,细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。,细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质改变,2.动物细胞培养条件：,1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。） 3、温度和PH36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、气体环境：O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）,保证细胞顺利的生长增殖,
