1、（四）诱导细胞凋亡的因子,物理性因子：包括射线（紫外线， 射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子 （TNF），抗 Fas/Apo-1/CD95抗体等。,（五）细胞凋亡的检测,形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察。 DNA电泳：DNA片段呈现出梯状条带。 TUNEL测定法：即DNA断裂的原位末端标记法。TUNEL是指末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法。此法可对凋亡细胞的核DNA中产生的3-OH断裂缺口进行原位标记。 彗星电泳法（comet assay）：又叫单细胞电泳
2、技术和微凝胶电泳。用以检测单个细胞中的DNA断裂。细胞凋亡中 DNA ladder 的出现被认为是细胞群发生凋亡的主要标志。细胞在凋亡过程中会有不同的DNA片段化程度，在电场中泳动速度较快，呈现出一种彗星式的图案。正常的无DNA断裂，在电场中泳动速度较慢，呈圆球形。 流式细胞分析：细胞凋亡中 DNA断裂，用碘化丙锭使DNA产生激发荧光。,IBRV,SBV,在细胞凋亡一词出现之前，胚胎学家已观察到动物发育过程中存在着细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）现象，它是胚胎正常发育所必需的。近年来PCD和细胞凋亡常被做为同义词使用，但两者实质上是有差异的。-首先，PCD是
3、一个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中，某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格控制的正常组成部分，而凋亡是一个形态学概念，指与细胞坏死不同的受到基因控制的细胞死亡形式；-其次，PCD的最终结果是细胞凋亡，但细胞凋亡并非都是程序化的。,2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。,Sydney Brenner,H. Robert Horvitz,John E. Sulston,三、细胞凋亡的分子调控机理,细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段
4、通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋亡也是受基因调控的精确过程。 细胞凋亡的途径主要有两条： 一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶 caspase。 一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活 caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。,（一）Caspase 家族与凋亡,1、Caspase家族Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。
5、它们均有以下特点：酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，所以命名为caspase（ Cysteine aspartic acic specific protease ），方便起见称之为凋亡酶；都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。,最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因是 ICE (Interleukin-1-converting enzyme) ，即：白介素-1 转换酶基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。在人类细胞中已发现11个 ICE 同源物，分为2个亚族： -ICE 亚族：参与炎症反应
6、-CED-3 家族，参与细胞凋亡，又分为两类：启动者（initiator）：如 caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起 caspase 级联反应，如 caspase-8 可依次激活 caspase-3、6、7。执行者（executioner或effector）：如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化或自剪接的方式激活； 细胞中还具有 caspase 的抑制因子，称为 IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），属于一个庞大的蛋白家族。它们能通过 BIR 结构域（baculovi
7、rus IAP repeats domain）与 caspase 结合，抑制其活性，如XIAP。,ICE家族成员 A：3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B：caspase-3的结构模型；C：caspase-3的活化过程,执行者,启动者,参与炎症反应,caspase 超家族成员及其相应底物,2、Caspase 活化,Caspase 自身以非活化的 Procaspase存在，其激活依赖于其他的 Caspase 在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化。Caspase-8自剪切活化，激活 Caspase-3，Caspase-7成为凋亡的执行者。Caspase-3 激活 C
8、aspase-6。Caspase 可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。Caspase 还可降解CAD的调节蛋白，释放出CAD，CAD进入细胞核降解 DNA。 CAD 为caspase-activated Dnase（脱氧核苷酸酶），存在于胞质中。,线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3，ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是ICE，即Caspase1。 ICE蛋白酶参与 Fas 诱导的细胞凋亡，与线虫细胞凋亡基因 ced-3 同源。 ced-4 在哺乳动物中的同源体为Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)，能激活Caspase3 ，这一过程需要细胞色素c（Apaf-2）和Apaf-3的参与。,（二）fas （ CD95）与细胞凋亡,fas 又称作 APO-1，属 TNF 受体和 NGF 受体家族。1993 年人白细胞分型国际会议统一命名为 CD95。fas 基因编码产物为分子量 45KD 的跨膜蛋白。Fas 蛋白与 Fas 配体组成 Fas 系统，二者的结合导致 靶细胞走向凋亡。,
