1、4、生长因子一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。需要量很少，例如各种维生素、碱基、卟啉、甾醇等。不同种类微生物对生长因子并非都须外界供给的。多数真菌、放线菌和不少细菌，都不需要外界提供生长因子；少数微生物还能自行合成过量的生长因子分泌到环境中，因此可用作维生素的生产菌种。,5、无机盐除碳、氮元素以外，对微生物生长繁殖所必需的无机物中的元素，如磷、硫、钾、镁、钠、铁和锌、锰、钼、钴、铜等。6、水水是微生物一切生命活动赖以进行的基本条件，虽较少用作真正的营养物，但因其不能缺少，故也属营养素之一。,（二）微生物培养基培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或产生代
2、谢产物的营养基质。它是微生物的营养基础，是合成代谢产物的物质来源。培养基成分和配比合适与否，对微生物生长发育、物质代谢、发酵产物的积累以及生产工艺等都有很大的影响。一种良好培养基的确定，往往要经过长期的反复的试验，并不断调整改进，逐渐趋于完善。同时，应根据菌种特性、发酵条件和工艺的改变进行相应的调整、改善。,除培养基组成外，还需考虑其他培养条件的控制，才能发挥其最大效能。任何培养基都应具备微生物生长所需要的6大营养要素，即碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水。在发酵过程中，为提高产物的量或减少杂质的生成，有时还添加前体、诱导物或抑制剂等成分。培养基配好后必须立即进行灭菌，否则会因杂菌生长而破
3、坏其固有成分和性质。,1、培养基的种类培养基按其组成物质的来源可分为合成培养基和天然培养基，前者所用原料的化学成分明确、稳定，但营养单一且价格昂贵，适用于研究菌种基本代谢和过程的物质变化，不适用于大规模工业生产。发酵工业普遍使用天然培养基，它的原料是一些天然的动植物产品，如花生饼粉、酵母膏、蛋白胨等。天然培养基的特点是营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。一般天然培养基中不需要另加微量元素、维生素等物质，而且组成培养基的原料来源丰富，价格低廉，适用于工业生产。,培养基按状态可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。固体培养基比较适用于菌种的分离和保存。半固体培养基即在配好的液体培
4、养基中加入少量琼脂，一般用量为0508，培养基即呈半固体状态，主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等。液体培养基中的8090是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基，它有利于氧和物质的传递。,培养基按其用途一般可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用的固体培养基。这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子并不易引起菌种发生变异。种子培养基一般指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基，这种培养基主要含有容易被利用的碳源、氮源、无机盐等，使孢子很快发芽、生长以及大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮和使各种有关
5、的初级代谢酶的活力提高。种子培养基要和发酵培养基相适应，成分不应相差太大，以避免种子对新环境的适应时间延长。,发酵培养基可供菌种生长、繁殖和合成产物。它既要使种子接种后能迅速生长达到一定的菌体浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需的产物，因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。 由于各种培养基的用途不同，其培养基的组成差异也很大。,2影响培养基质量的因素（1）原材料质量的影响 培养基所用的原材料大多为复合材料，其中不少天然原料成分复杂，如玉米浆、黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨等往往因品种、产地、加工方法和贮藏条件的不同而造成内在质量较大的波
6、动。（2）水质的影响 发酵工业所用的水有深井水、地表水、自来水和蒸馏水等。深井水的水质可因地质情况、水源深度、采水季节及环境不同而不同，地表水的水质受环境污染的影响更大。,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。在抗生素发酵工业中，由于水质不同而导致这结果差异也时有发生。因此，有的国家为了避免水质变化对抗生素发酵产生影响，提出配制抗生素工业培养基的水质要求：浑浊度20、色级25、pH6872、总硬度100230mgL（ppm）、铁离子0104mgL（ppm
7、）、蒸馏残渣150mgL（ppm）。,（3）灭菌操作 培养基必须经过灭菌方可使用，目前大多数生产用培养基均采用高压蒸汽灭菌法，灭菌时，营养成分会受到一定程度的破坏。如葡萄糖在高温下易与氨基酸和其他含氨基的物质反应，对微生物有一定的毒性。磷酸盐与碳酸钙之间，磷酸盐、镁盐和铵盐之间也发生化学反应，生成沉淀或络合物，使可利用的磷酸根和铵离子的浓度大为降低。此外，蛋白质在高温下变性，维生素在高温下失活。因此，灭菌操作的不当不仅会减少培养基中有效的营养成分，还会产生一些有毒物质，给发酵带来不利的影响。,（4）培养基黏度的影响 培养基中一些不溶性的固体成分，如淀粉、黄豆饼粉等增加了培养基的黏度，直接影响微
8、生物对溶解氧的利用，给产品的后提取也带来不便。在大规模发酵，对由于淀粉含量过高，不仅成本增加且使发酵液黏稠而影响生物合成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补。工业生产中还可采用精料发酵、基础原料液体化（即用蛋白酶水解各种饼粉），或采取补加无菌水的方法，来降低培养基的黏度，以提高发酵水平。,（三）灭菌与除菌方法1、灭菌方法（1）加热灭菌这是大规模装置中最行之有效的灭菌方法。影响这种方法有效程度的因素主要有：待杀灭微生物的种类、待灭培养基的组成、pH以及培养基中颗粒成分的粒度。一般说，生物的营养体在较低温度下很快就可杀灭；而要杀死微生物的孢子，则需要至少121高温。在所有的微生物孢子中
9、，嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子对热的耐受性最强，因此，人们常常用它作为检验灭菌是否彻底的指标。,常用的加热灭菌方式有高温蒸汽湿热灭菌法和干热灭菌法。湿热灭菌比干热灭菌更为有效，因蒸汽在冷凝时要释放大量的潜能，且蒸汽有强大的穿透力，易于传热。这种方法普遍被用来对培养基和设备容器进行灭菌。干热灭菌只适用于工业要求为灭菌后能保持干燥状态的物料灭菌。实验室规模的玻璃器皿等器具常采用干热灭菌。一般干热灭菌的条件是160，120min。,（2）辐射灭菌辐射灭菌即利用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射灭菌，其中以紫外线最常用。紫外线对微生物有杀灭作用。其波长在210313.2nm范围内有效，常用的有效波长为253.
10、7nm。这与微生物体内核酸的吸收光谱相一致，DNA链上核苷酸的碱基因具有强烈的吸收紫外线的能力而引起DNA结构的变化，如DNA链的断裂。DNA分子内和分子间的交联，嘧啶二聚体的形成等，其中胸腺嘧啶二聚体的形成是紫外线改变DNA生物功能的重要途径。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但其穿透力极低，它对真菌孢子的杀灭能力不大。,（3）介质过滤除菌对培养液中某些不耐热的成分可采用过滤除菌法，例如可用滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石棉板过滤器、素烧瓷过滤器以及硅藻土过滤器等。发酵过程中所用的大量无菌空气也是采用过滤除菌法。传统的过滤方式是深层过滤，所采用的过滤介质有棉花、玻璃纤维、活性炭、石棉滤板
11、和活性炭纤维素等。深层过滤的除菌效果靠多种物理因素的共同作用来完成，这些因素主要包括沉降作用、扩散作用、惯性撞击作用、拦截作用和静电吸附作用等。但它们存在着使用寿命短、更换作业麻烦的缺点。,又开发了一些新的过滤介质，如烧结金属板、烧结金属管、烧结玻璃纤维以及硝酸纤维酯、聚砜、聚四氟乙烯、尼龙微孔滤膜等。这些过滤介质具有与深层过滤相同的过滤除菌效果，且使用寿命较长，介质更换作业简便，因而使用起来要方便得多。从大气空间采集的空气，在进过滤器之前，还要经过一系列复杂的处理过程，以尽量除去其中的粉尘、油和水，从而确保进罐空气的洁净，如图2 5所示。,（4）化学灭菌法化学灭菌法是通过药剂与微生物细胞接触
12、而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的目的。常用的化学药剂包括乙醇、甲醛、苯扎溴铵（新洁尔灭）、戊二醛、环氧乙烷、含氯石灰（漂白粉）和苯酚（石炭酸）等。化学灭菌主要用来进行皮肤表面、器具及无菌区域的灭菌，不能用于培养基的灭菌。 乙醇。乙醇具有杀菌作用，其杀菌能力随浓度不同而变化，浓度过高，乙醇会使微生物细胞膜上的蛋白质凝固，降低其渗透力，影响杀菌效果，浓度过低则杀菌力减弱。实验证明，以7075的乙醇杀菌作用最强。常用于操作台面、皮肤及器具表面消毒。, 甲醛。可将甲醛溶液（37）直接加热，按18mlm2计算用量，在12h内产生的气态甲醛可杀灭所有营养细胞。还可用氧化熏蒸法，即用高锰酸钾（用
13、量为甲醛的一半）与甲醛混合，利用氧化反应产生的热量使甲醛挥发成气体进行杀菌。此法只适用于密闭空间空气的灭菌。 新洁尔灭（苯扎溴铵）。按所购商品1：50稀释后，可用于皮肤表面、操作台面及有关器具消毒。本品配制后的溶液可反复使用40次。, 石炭酸。石炭酸是一种常用的消毒剂，其渗透力很强，配成35的水溶液，可用于接种室内喷雾，进行桌面、地面和墙壁的消毒。 气体灭菌法。气体灭菌是使用气体化学试剂对固型材料进行灭菌的方法。此方法适用于不耐热或不宜沾水的材料。用作灭菌剂的气体（环氧乙烷）是可燃性的，毒性很强，使用时要特别注意安全防护。,2培养基与发酵设备的灭菌方法工业生产上通常采用的蒸汽灭菌法，包括实罐灭
14、菌（实消）、空罐灭菌（空消）、连续灭菌（连消）及附属设备灭菌。 （1）实罐灭菌（实消）实消是将配制好的培养基投入发酵罐中，同时开动搅拌器，通入高温蒸汽进行灭菌。实消的温度一般为121。灭菌时间则视培养基组成、罐容积而定，一般在3060min之间。在灭菌过程中，应让高温蒸汽通过所有与发酵罐相连的管道、接口、阀门与电极，以避免在这些部位留下死角而引起杂菌污染。,实消又分直接加热和间接加热两种形式。间接加热是使高温蒸汽通过发酵罐的夹层或内部蛇管，与培养基发生热交换；而直接加热则是使经纯化处理、不含杂质的高温蒸汽通入培养基中，使其温度在短时间内升至要求的温度。在蒸汽与培养基直接接触时，有一部分蒸汽要冷
15、凝成水，从而使培养基稀释，因而在配制培养基时应预先扣除这部分冷凝水。 在实消过程中，通常同时使用直接加热和间接加热两种方式，一般的做法是，用间接加热方式进行预热，使罐温升至8090，然后同时采用直接加热和间接加热两种方式，使温度迅速升至121。,实消过的培养基，要采用一定方式将其温度降至发酵接种温度。这部分热量往往无法重复利用，因而，实消的能耗很高。值得注意的是，在高温杀菌的同时，可能会引起培养基成分的变化，尤其是维生素等耐热性差的物质尤为如此。糖类与氨基酸等有机氮源在高温灭菌时容易形成5羟基糠醛和其他棕色物质，对微生物的生长代谢有一定的毒副作用。另外，灭菌时磷酸盐和碳酸盐之间相互作用，可形成
16、不溶于水的磷酸钙，降低可溶性磷的含量。其pH也会发生较大幅度的变化，一般灭菌前后培养基pH变化在0.20.5之间，有时也会超过1个pH单位。,（2）空罐灭菌（空消）空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。空罐灭菌一般维持罐压1.51052.0105Pa、罐温125130、时间3045min。灭菌时要求总蒸汽压力不低于3010535105Pa，使用压力不低于2510530105Pa。灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过连续灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。 （3）连续灭菌（连消）培养基通过连续灭菌装置、进行快速连续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中，需要较高的
17、温度和较短的时间。其操作包括以下步骤：, 培养基预热。将料液预热到6075，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。 连续灭菌。连续灭菌是在连消塔中完成的。连消塔的主要作用是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液温度很快升高到灭菌温度。连续灭菌的温度一般以126132为宜，由于输送培养基的连消泵的出口压力一般为6105Pa，所以总蒸汽压力要求达到4510550105Pa以上。只有当两者压力接近，培养基流速才能均匀稳定，否则流速非快即慢，影响灭菌质量。, 维持灭菌温度。由于连消塔加热时间较短，光靠这短时间的灭菌是不够的。因此，利用维持罐使料液在灭菌温度下保持57min，以达到灭
18、菌的目的。维持罐的罐压一般维持在4105左右。 冷却 生产上一般采用冷水喷淋冷却，即用冷水在排管外从上向下喷淋，使管内料液逐渐冷却。一般料液冷却到4050后，输送到预先空消过的罐内。在冷水喷淋前，冷却管内应充满填料。连续灭菌的时间短、温度较高，培养基受到的破坏较少，故质量较好。连续灭菌时蒸汽负荷均衡一致。但不足之处是所需设备较多。操作较麻烦，染菌的机会相应增多。,（4）发酵附属设备及管路的灭菌发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。一般糖水罐灭菌时罐压为l105Pa、时间为30min：油罐（消沫剂罐）灭菌的蒸汽压力为1.51051.8105Pa、时间为60min。总空气过滤器灭菌时
19、，灭菌时的蒸汽压力为3.5105Pa左右，总过滤器内压控制为1.51052.0105Pa（表压），灭菌时间为2h。灭菌完毕，自上端输入空气，自上而下吹干过滤介质。,管道灭菌的蒸汽压力不应低于3.4105Pa（表压），灭菌时间为1h。新安装的管道或长期未使用的管道灭菌时间可适当延长到1.5h。灭菌后以无菌空气保压，自然冷却30min即可交付使用。,（四）微生物的培养方法将微生物接种于培养基中，在特定的条件下增殖，此过程称为培养。特定条件一般是指温度、通气、pH和培养基组成。 1培养装置 （l）恒温箱 它是将微生物保持在一定温度进行培养的器具。可用于斜面和平板静置培养。 （2）振荡培养器 用于好气
20、菌的液体培养。旋转式振荡器：三角烧瓶。往复式振荡器：试管、三角烧瓶等。独臂振荡器：L型管。,（3）其他 对于嫌气菌或分解气体菌的培养，使用密闭型或能够交换气体的容器。大量液体培养使用发泡塔、发酵桶、发酵罐。特殊装置。,2培养方法 （1）固体培养法 斜面培养。对于细菌、酵母，用接种针在斜面培养上划一条直线或全面涂抹；对于霉菌，则取一部分孢子或菌丝体在斜面上划成弯曲钩状，然后进行培养。 平板培养。对于细菌、酵母，在平板培养基上适当涂抹，对于霉菌，接种时要将平板反过来，从下轻轻一点即可，然后再翻过来培养。 穿刺培养。常用于嫌气菌（乳酸菌等）的保藏或明胶的液化试验等。它用接种针对深层培养基穿刺接种后培
21、养，若是产生气体的菌会发生龟裂现象。, 其他固体培养法。此类培养为用米曲、马铃薯和面包进行的培养。 （2）液体培养法 静止培养法。一般用于酵母、嫌气性细菌、兼性嫌气性细菌的培养以及各种生理试验等。对于霉菌也可在液体培养基中使用称作表面培养的静置培养法。 振荡培养法。这是实验室最常使用的好气性菌、兼性菌的液体培养法。,为提高搅拌效果，增加通气量，可在装有档板的烧瓶内培养，此时必须控制液量不要使塞弄湿，因为塞沾湿后易污染杂菌，并同时降低通气效果。试管振荡器主要用于菌种筛选等大量菌株的处理。 通气搅拌培养法。在发泡塔、发酵桶、发酵罐等容器内的培养，均采用通气搅拌式的大规模培养。,三、发酵过程的控制
22、（一）发酵过程的主要控制参数1、物理参数（1）温度（） 指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。（2）压力（Pa） 这是发酵过程中发酵罐维持的压力。罐内维持正压可以防止外界空气中的杂菌侵入而避免污染，以保证纯种培养。,（3）搅拌转速（rmin） 指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每lmin的转速来表示，它的大小与氧容量传递速率与发酵液的均匀性有关。（4）搅拌功率（kW） 指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每lm3发酵液所有消耗均功率（kW/m3）。它的大小与氧容量传递系数KLa有关。,（5）空气流量L（Lmin）空气流量是每1min内每单位体积发酵液通入空气的体积，也是需氧发酵的控制参数。它的
23、大小与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制在0.51.0L（Lmin）范围内。 （6）黏度（Pas） 黏度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。通常以表观黏度表示。它的大小可改变氧传递的阻力，又可表示相对菌体浓度。 （7）浊度（） 浊度能及时反应单细胞生长状况的参数，对某些产品的生产是极其重要的。 （8）料液流量（Lmin） 这是控制流体进料的参数。,2、化学参数 （1）pH（酸碱度）发酵液的pH是发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。它是发酵工艺控制的重要参数之一。 （2）基质浓度（g100ml或mg100ml）指发酵液中糖、氮、磷等重要营养物
24、质的浓度。它的变化对产生菌的生长和产物的合成有重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。 （3）溶解氧浓度106（ppm）或饱和度（） 溶解氧是需氧菌发酵的必备条件。利用溶氧浓度的变化，可了解产生菌对氧利用的规律，反映发酵的异常情况。,（4）氧化还原电位（mV） 培养基的氧化还原电位是影响微生物生长及其生化活性的因素之一。 （5）产物的浓度（gml或Uml） 这是发酵产物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数，也是决定发酵周期长短的根据。 （6）废气中的氧浓度（h） 废气中氧含量与产生菌的摄氧率和KLa有关。 （7）废气中的CO2浓度（） 测定废气中的CO2可以算出产生菌的呼吸熵，从而了解
25、产生菌的呼吸代谢规律。除上述外，还有跟踪细胞生物活性的其他参数，需要时可查有关资料。,3生物参数 （1）菌丝形态 丝状菌发酵过程中菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映。一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。 （2）菌体浓度 菌体浓度是控制微生物发酵的重要参数之一，特别是对抗生素次级代谢产物的发酵。在生产上，常根据菌体浓度来决定适合补料量和供氧量，以保证生产达到预期的水平。根据发酵液的菌体量和单位时间的菌浓、溶氧浓度、糖浓度、氮浓度和产物浓度的之比值，这些参数也是控制产生菌代谢、决定补料和供氧条件的主要依据，多应用于发酵动力学的研究。,（二
26、）发酵过程的变化规律与控制1、分批发酵分批培养是指在一封闭培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方法。（1）迟滞期 在接种后，这是一个不生长期。迟滞期的长短与3个因素有关，一是新的培养基组成及培养条件与旧的越接近，则一般迟滞期越短；二是种子的质量，一般移种对数生长期的比移种其他生长期的细胞迟滞期短；三与接种量有关，接种量大，迟滞期要相对短些。,（2）对数生长期 在这个分期中，细胞的生长率逐渐加大，达到最大生长率，此时将菌体浓度的自然对数与时间作图可得一直线。处于对数生长期的微生物其各种酶系的活力最强，因此工业生产中，常以此作为种子移入新环境中以缩短发酵过程中的迟滞期。 （3）减速期和稳定期 在培
27、养过程中，培养基中的营养物逐步耗尽，微生物生长速度变慢（进入减速期），直至停止（进入稳定期）。由于这一时期菌体代谢十分活跃，有许多次级代谢产物在此期合成，因此也被称为生产期或分化期。,2、补料分批发酵在发酵过程中采用补料分批培养技术的优越性如下。 （1）可使底物的残留浓度保持在较低的水平，以免微生物受到这些底物的调节作用。 （2）能够增加微生物细胞的合成能力。通过补料工艺能够不断地提供足够的养料用于合成微生物细胞。 （3）能够提高非生长偶联型产物（如抗生素等次级代谢产物）的合成量。 （4）可以解除快速利用底物而造成的阻遏效应。 （5）能够降低发酵液的黏度，提高溶解氧的浓度。,3、连续发酵所谓连
28、续发酵是指培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液的过程。连续发酵具有以下3个优点。 （l）能维持较低的基质浓度，有利于产物形成。 （2）可以提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间。 （3）由于发酵罐内微生物、基质、产物和溶解氧浓度等各种参数维持在一定水平，故便于自动化控制。连续发酵由于长时间的连续培养难以保证纯种培养。且菌种发生变异的可能性较大。,（三）发酵过程的重要影响参数与控制 1、温度的影响及与控制不同的微生物菌种的最适生长温度和产物形成的最适温度都是不同的。在发酵过程中，可用发酵热代表整个发酵过程中释放出来的净热量：Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q湿Q辐射最适发
29、酵温度随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段而改变，理论上，在整个发酵过程中不应只选一个培养温度，而应根据培养的不同阶段调整温度，以达到最佳效果。,2、pH的影响与控制微生物生长都有最适pH范围及其变化的上下限，超出此上下限，菌体将无法忍受而自溶。pH对产物的合成也有明显的影响。合适的pH是根据试验结果来确定的。在发酵过程中，首先考虑和试验发酵培养基的基础配方，采用适当的配比，使发酵过程中pH变化在合适的范围内。因为培养基中含有代谢产酸和代谢产碱物质以及缓冲剂，它们在发酵过程中要影响pH的变化。如果达不到要求，就可在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制。,3、溶氧的影响与控制溶氧是需
30、氧发酵控制的最重要参数之一。氧在水中的溶解度很小、所以需要不断通气和搅拌，才能满足溶氧的要求。溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成，但溶氧太大有时反而会抑制产物的形成。因此需考查每种发酵的临界氧浓度和最适氧浓度。在已有设备和正常的发酵条件下，每种产物发酵过程中溶氧的变化都有自己的规律，并与菌体自身的繁殖和代谢密切相关。出现溶氧浓度明显降低或明显升高的异常变化，这可能有几种原因：, 污染了好气性杂菌，大量的溶氧消耗； 菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降； 某些设备或工艺控制发生故障或变化，如搅拌功率消耗变小或搅拌速度下降等，也可能引起溶氧的下降。因此，从发酵液中溶解氧的浓度的变化，可了
31、解微生物代谢是否正常，工艺控制是否合理。设备供氧能力是否充足等问题，以帮助查找不正常的原因和控制好发酵生产。,4二氧化碳的影响与控制CO2是微生物生长繁殖过程中的代谢产物，也是某些合成代谢的基质，对微生物生长和发酵具有刺激或抑制作用。 CO2还能使发酵液的pH下降，或与其他物质如生长所必需的金属离子形成碳酸盐沉淀等，造成间接作用而影响菌的生长代谢和产物的合成。CO2在发酵液中的大小受到许多因素的影响，由于CO2的溶解度随压力增加而增大，大发酵罐中发酵液的静压较大，尤其在罐的底部，CO2浓度较大。形成碳酸，进而影响菌体的呼吸和产物的合成。,采用增加罐压的方法来消泡。也会增加CO2的溶解度，对菌体
32、产生不利的影响。CO2浓度的控制可通过通气搅拌来控制，对其形成的碳酸，可用碱来中和，罐压的调节，也影响CO2的浓度，对菌体代谢和其他参数产生影响。,5泡沫的影响与控制在大多数微生物发酵过程中，由于培养基中有蛋白质类表面活性剂存在，在通气条件下，培养液中就形成了泡沫，起泡会带来许多不利因素，如发酵罐的装料系数减少，氧传递系数减小等。泡沫过多时，可能会造成大量逃逸，发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会等。所以，控制泡沫乃是正常发酵的基本条件。泡沫的控制，可采用调整培养基成分、改变某些物理化学参数或者改变发酵工艺来控制，但这些方法的效果有一定限度。采用消沫的方法是公认的比较好的方法。,消沫可以用
33、机械消沫和消沫剂消沫两大类方法：机械消沫是利用机械强烈振动或压力变化而使泡沫破裂，常用在罐内靠消沫浆转动打碎泡沫，但消沫效果不理想。另一种消沫的方法是采用外加消沫剂，使泡沫破裂。常用的消沫剂主要有天然油脂类，高碳醇、脂肪酸和酯类，聚醚类，硅酮类等。其中以天然油脂类和聚醚类在微生物发酵中最为常用。天然油脂中有豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和猪油等。油不仅可作消沫剂，还可作为碳源和发酵控制的手段。,第三节 生物技术制药工艺技术基础、基因工程制药技术基础基因工程药物制造过程的主要程序是：获得目的基因构建DNA重组体将重组体导入宿主细胞鉴定筛选阳性克隆构建基因工程菌（或工程细胞）培养工程菌分离纯化表达产
34、物除菌过滤半成品检定制剂成品检定包装，以上程序的每个阶段都包含若干操作技术单元，并依产品的性质，随研究和生产条件的不同而有所改变。,通常将上述制造过程分为上游和下游两个阶段。上游阶段是研究开发基因工程药物的必不可少的基础，主要包括分离获得的目的基因，获得重组DNA，阳性克隆的筛选与鉴定及构建工程菌（工程细胞）等步骤。下游阶段是从工程菌（工程细胞）的大规模培养直到产品的纯化、制剂和成品的检定与包装。上游阶段的工作主要在实验室完成，其主要技术过程分为下列5个部分。,1、获得具有遗传信息的目的基因从复杂的生物体基因组中采用不同方法分离并获得带有目的基因的DNA片段。获得目的基因主要通过下述方法。 （
35、1）鸟枪克隆法 一般包括提取细胞总DNA，经过酶切、克隆至特定载体，再转化至特定宿主细胞，构建成具有一定大小的基因文库，以同源基因为探针，进行杂交获得的目的基因。 （2）人工合成目的基因 人工合成目的基因主要采用下列3种途径。, 酶促方法。经提取获得编码基因的信息RNA（mRNA），在逆转录酶的作用下，合成互补DNA（cDNA）链，在DNA聚合酶I的作用下，加工成为双链DNA分子。 化学合成法。 前提是必须已知基因的核苷酸序列，化学合成的DNA片段一般较短，需要用DNA连接酶进行连接，从而获得较长的DNA片段。 聚合酶链反应（PCR）。先决条件是必须已知基因的核苷酸序列，根据序列设计引物，进行
36、PCR扩增获得的目的基因。也可以采用反转录PCR（RT PCR）等方法，直接从富含目的基因的实验材料提取RNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增获得目的基因。,2、选择基因载体构建重组DNA在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接，获得重组DNA分子。常见基因载体有质粒、噬菌体、黏粒、病毒载体等。3、将重组DNA分子导入宿主细胞采用特定的方法将重组DNA分子转移至适当受体细胞（也称寄主细胞），并与之同步增殖。被导入的受体细胞分为两大类：第一类为原核细胞；第二类为真核细胞，此外为动物细胞、植物细胞。另外也可以导入动物和植物体。
37、导入的方法主要有转化、转染等方法，此外也可采用电融合、显微注射和基因枪等技术。,4、鉴定带有目的基因的克隆从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞。针对不同基因的表达产物，采用各自特有的测活方法；也可以采用酶联免疫方法确定其抗原性；以目的基因为探针，通过DNA杂交方法可以直接确定重组子。5、目的基因的扩增及获得目的产物培养克隆有目的基因的重组子，提取获得扩增的目的基因以进行深入的研究。将目的基因克隆至适当的表达载体，采用特定的方法将基因导入受体细胞，使其在新的遗传背景下获得活性表达，从而得到人类需要的特定目的物质。,（一）基因工程的主要操作技术1、目的基因的制备为实现某一目
38、的基因（靶基因）的转移与表达，首先必须克隆得到该基因。在技术路线或操作细节技巧上也会有所差异。目前常用的有三种方法：构建cDNA文库，筛选目的cDNA；通过聚合酶链反应（PCR）方法得到目的基因； 人工化学合成方法制备。,（1）cDNA文库的建立与目的基因的分离在高等生物中由于结构基因是由外显子（蛋白质编码序列）与内含子（非蛋白质编码的间隔序列）排列组成的，其转录物需要经过剪接去除内含子，使外显子连接加工产生成熟的mRNA，为获得完整的能直接进行表达的真核生物编码目的基因，就必须构建cDNA文库。所谓cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，不含有任何内含子序列，可以在任
39、何一种生物体中进行表达。将细胞总mRNA反转录成cDNA并获得克隆，由此得到的cDNA克隆群体称为cDNA克隆群体，也称为cDNA文库，它代表了某种生物的全部mRNA序列，即蛋白质编码信息。,（2）通过PCR技术制备目的基因 PCR基本原理PCR技术可在短时间内于试管中获得数百万个特异DNA序列的拷贝。它实际上是在欲扩增的目的DNA的两侧设计一对正向和反向引物，在模板DNA以及四种脱氧核糖核酸（4dNTPs）底物存在的条件下由TaqDNA聚合酶所引导催化的DNA扩增酶促反应。PCR由3个基本反应组成：a、高温变性。通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。,b、低温退火。使温度
40、下降，引物与模板DNA中所要扩增的目的序列的两侧互补序列进行配对结合。c、适温延伸。在TaqDNA聚合酶、4dNTPs及Mg2存在下，引物3端向前延伸，合成与模板碱基充列完全互补的DNA链。以上变性、退火和延伸便构成一个循环，数小时之后（约2530次循环），介于两引物间的目的DNA片段便可扩增105107拷贝（图2 11）。,通过在引物的5端添加额外的与模板不互补的所需DNA序列，如限制性酶切位点、起始密码子、核糖体结合位点、启动子、终止密码及终止子等，便可以将其引入目的基因中，从而方便进行目的基因的克隆、表达与调控研究。,（3）人工合成目的基因最简单的办法就是首先利用化学合成法分别合成两条互
41、补的寡核苷酸链，然后让这两条链在适当条件下退火，形成双链。但是这种方法仅限于合成组装较短的基因（6080bp），这是由于随着寡核苷酸链合成长度的增加，出错率也会增加，同时产物的得率也会下降。人们尝试采用了多种人工基因组装方法（图2 12）。,2、重组子的构建目的基因必须与载体连接形成一种重组DNA分子，并转入相应的宿主细胞后才能实现目的基因的克隆与表达。根据目的基因片段的来源与类型不同，可以采取不同的连接策略，目前应用较多的连接方式有3种：黏端连接、平端连接和TA克隆。 （1）黏端连接黏端连接是指目的基因与载体之间具有彼此互补的黏性末端，在较低的温度下可以形成氢键，再通过T4DNA连接酶便可以
42、连接成完整的重组DNA分子。,（2）平端连接有时为了满足实验设计的需要，必须进行DNA的平齐末端之间进行连接。因为除内切酶酶切DNA直接产生的平齐末端分子外，黏性末端通过一定的修饰也能产生平齐末端。平齐末端的连接效率较低。因此，在进行平齐末端连接时一般需加入更多的T4DNA连接酶，同时适当提高DNA底物浓度。 （3）TA克隆TA克隆是一种直接将PCR基因产物进行快速克隆的方法。,其原理是，在PCR反应过程中热稳定聚合酶（即Taq聚合酶）可以向PCR产物的3末端加上一个不依赖于模板的腺苷酸（A）。利用这个末端突出的3A，即可将PCR产物直接插入到插入位点只有一个3T突出的线性T载体分子。这种方法
43、只限于PCR产物的克隆，且必须采用3T突出的T载体。,3、DNA重组体导入宿主细胞技术 （1）DNA重组体导入微生物细胞的方法转化作用。转化是指微生物细胞直接吸收外源DNA的过程，而通过转化接受了外源DNA的细胞称为转化子。在分子克隆中，宿主细胞需经人工处理成能吸收重组DNA分子的敏感细胞才能用于转化，此时的细胞称为感受态细胞。将细菌处于0的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球型（感受态），经42短时间热冲击后，细胞可吸收外源DNA，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原，并分裂增殖。,除化学法转化细菌外，还可采用高压脉冲电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA
44、进入细胞。 转导作用。噬菌体载体所构建的重组DNA分子可以直接感染进入E.coli寄主细胞内，这叫转染，但转移效率很低。为了提高转移效率，重组的噬菌体DNA或重组的黏粒DNA必须包装成完整的噬菌体颗粒，通过温和噬菌体颗粒的释放和感染将重组DNA转移至宿主内，这称为转导，而通过转导接受外源DNA的细胞则称为转导子。,（2）DNA重组体导入动植物细胞的方法随着高等动植物细胞基因工程的发展，人们发明了多种基因转移技术，根据原理不同，主要可分为物理方法、化学方法和生物学方法3大类，见表2 6。 4、筛选与鉴定带有目的基因的阳性克隆为了提高筛选效率，建立好的筛选模型十分重要。因此，在进行基因克隆实验设计
45、时首先必须考虑重组子的筛选方案，根据目的基因的特性，选择合适的载体与宿主细胞。,（1）根据遗传表型差异进行筛选由于外源基因的插入使得载体分子上的一些筛选标记基因的失活，从而导致宿主细胞的某些遗传表型的改变，便可直接筛选出重组子菌落。抗药性筛选。在含有两个抗药性基因的载体中，插入失活其中一个基因，再用两个不同抗性平板对照筛选出重组子。半乳糖酶显色反应选择。噬菌斑形成能力没有外源DNA插入的载体不能包装成噬菌体颗粒，不能感染细菌形成噬菌体。,（2）根据重组子的结构特征进行筛选 快速裂解菌落比较重组DNA分子大小。直接进行凝胶电泳。 限制性内切酶分析。即快速提取质粒DNA，用限制性内切酶进行双酶切，
46、将酶切产物进行凝胶电泳分析，与分子质量标准作对照，根据片段的大小和酶谱特征判断是否为阳性克隆。 原位杂交。原位杂交是以基因探针检出培养板上阳性重组子菌落位置的技术。是从基因文库筛选阳性克隆的首选方法。, PCR筛选法。根据目的基因两端已知核苷酸序列设计合成一对引物，依据实验目的与要求的不同快速抽提宿主细胞质粒DNA或染色体DNA作为模板进行PCR扩增反应，将扩增反应物进行凝胶电泳分析，若出现特异片段的扩增条带，即说明该克隆为阳性克隆。该法快速、灵敏、简单、易行，广泛应用于阳性重组子的筛选。,5、基因表达系统基因工程的最终目的是在合适的宿主系统中使目的基因获得高效表达，从而生产出有重要价值的目的
47、蛋白质或多肽。 （1）大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统虽然不能像真核系统那样进行翻译后加工（尤其不能进行糖基化），因此像EPO等需要糖基化才有活性的目的蛋白不能在该体系进行表达。但它具有遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便，繁殖力强（平均2030min即可繁殖一代），便于大规模培养，成本较低，表达水平较高，下游技术成熟、易于控制。是目前使用最广泛、最成功的表达系统。,启动子和终止子。启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并启动mRNA合成的长4050bp序列。原核生物启动子包括两个高度保守区域，一是Pribnow box，位于起始位点上游510bp，由68bp组成，富含A、T，故又称为
48、TATA box或10区，来源不同的启动子，Pribnow box的碱基序列稍有变化； 另一个是35区，位于转录起始位点上游约35bp处，一般由10bp组成。35区提供了RNA聚合酶识别信号。5ITGACATATAAT3,启动子有强弱之分，强启动子与RNA聚合酶结合紧密，可使基因获得高水平转录，弱启动子则相反。原核启动子聚合酶不能识别真核细胞启动子，因此只有将真核基因置于原核生物强启动子下游才能实现高效转录。终止子是指一个基因或操纵子3末端能有效终止转录的一段特定的DNA序列。在构建基因表达载体时，为了防止过度转录而引起载体不稳定，以及杂蛋白的合成，一般在外源基因下游插入一强转录终止子。,SD
49、（ShineDalgamo）序列。大肠杆菌核糖体结合位点对外源基因的高效表达十分重要。mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码AUG上游311bp处的序列，SD序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16s r RNA 3末端的富含嘧啶的序列互补，可促进mRNA与核糖体结合，提高翻译效率。SD序列与起始密码子之间的距离，也是mRNA翻译效率的重要因素。有人指出，SD序列与AUG之间的最佳距离为（93）bp。另一个影响外源基因mRNA翻译效率的重要因素是mRNA二级结构，通过减少二级结构的形成，可以提高mRNA翻译水平。,非融合表达。表达蛋白的N端不会有任何其他原核生物肽段的蛋白质称为非融合蛋白。为了实现非融合表达，必须将带有起始密码AUG的外源基因插到原核启动子和SD序列的下游，组成一个杂合的核糖体结合位点，经转录翻译，表达出非融合蛋白。非融合表达的优点在于，表达的非融合蛋白与天然蛋白在结构、功能以及免疫原性等基本一致。缺点是，表达产物N端不可避免地带上一个甲硫氨酸，一级结构与天然蛋白存在差异；其次，当进行高表达时表达产物易形成包涵体，包涵体的处理往往需要采用强变性剂将包涵体溶解，然后再进行产物复性，最后才能得到具有生物活性的目的重组蛋白，且复性得率很低。,
